Cl ca: 55-9906-CA-CL | LEDS C4

Содержание

Сдать K+, Na+, Ca++, Cl- анализ во Владимире

Описание

Минеральный обмен - K+, Na+, Ca++, Cl- Сроки исполнения: 1 рабочий день*. Биоматериал: кровь. Описание: Подготовка к исследованию: натощак, между забором крови и последним приемом пищи должно пройти не менее 8 часов. Справка: K+, Na+, Ca++, Cl- – это комплексный анализ, предназначенный для оценки электролитного баланса и кислотно-основного равновесия крови. Калий (К+) – основной катион внутриклеточной жидкости, а натрий (Na+) – основной катион внеклеточного пространства. Оба эти элемента являются важными регуляторами водно-солевого обмена организма. Калий участвует в создании и поддержании электрического мембранного потенциала клеток. Регулирует внутриклеточное осмотическое давление, стимулирует активность ферментов гликолиза, участвует в метаболизме белков и гликогена, играет важную роль в формировании потенциала действия в нервных и мышечных клетках и проведении нервных импульсов, обладает иммуномодулирующей активностью. Натрий является важнейшим осмотическим компонентом внеклеточного пространства, с которым связана регуляция объема внеклеточной жидкости. 96% общего количества натрия в организме содержится вне клеток. Он участвует в проведении возбуждения в нервных и мышечных клетках, в формировании щелочного резерва крови и транспорте ионов водорода. Ca++ - физиологически активная часть кальция крови, посредством которой осуществляются все его биологические эффекты (участие в мышечном сокращении, в механизмах секреции гормонов, рецепторных процессах, в механизмах клеточного деления и так далее). Свободный кальций составляет от 43% до 50% общего кальция, его концентрация варьирует в течение суток: минимальная концентрация в 20 ч, максимальная в 2-4 часа ночи. Ионизированный кальций участвует в регуляции кислотно-основного состояния крови, его уровень поддерживается паратгормоном, кальцитонином, активной формой витамина D3, а продукция этих гормонов, в свою очередь, зависит от уровня Ca++. Cl- является одним из основных внеклеточных анионов. Он находится в основном вне клеток, играет роль в поддержании кислотно-основного состояния и в распределении воды в организме. Действие хлора в крови разнообразно — он регулирует кислотно-щелочной баланс крови и поддерживает осмотическое давление, баланс воды в организме. Он активирует амилазу, участвует в образовании соляной кислоты желудочного сока, улучшает функцию печени. Обмен хлора регулируют гомоны коркового вещества надпочечников и щитовидной железы. Содержание хлора в организме зависит от баланса процессов поступления хлоридов с пищей, распределения их в организме и выведения с мочой и калом. Показания к назначению: исследование электролитного состава крови при различных патологических состояниях, мониторинг течения различных заболеваний. Интерпретация результатов: Концентрация калия в сыворотке крови зависит от равновесия следующих процессов: поступления калия извне, распределения в организме и выведения (почками, потовыми железами, через кишечник). А поскольку он не депонируется в организме, даже при небольших изменениях концентрации калия внутри клеток значительно изменяется его концентрация в плазме. Захват калия клетками стимулируется инсулином, также захват калия клетками усиливается под действием катехоламинов, альдостерона. Изменения рН крови приводят к изменению содержания К+ в клетках: при ацидозе - он выходит из клеток в плазму, при алкалозе поступает внутрь клеток. При гиперкалиемии отмечаются желудочковая тахикардия, фибрилляция желудочков и даже асистолия. При гипокалиемии развиваются мышечная слабость, снижение рефлексов, гипотония, нарушения в проводящей системе сердца, непроходимость кишечника, полиурия. Концентрация натрия в плазме (сыворотке) зависит от равновесия следующих процессов: поступления натрия, распределения его в организме и выведения почками, потовыми железами. Основными регуляторами обмена натрия в организме являются ренин-ангиотензин-альдостероновая система, антидиуретический гормон, предсердный натрийуретический гормон. Значительные изменения уровня натрия в плазме крови происходят вследствие непропорциональных потерь воды и солей из организма. Важно определять значения Ca++ при изменениях кислотно-основного состояния (КОС) крови: алкалоз увеличивает связывание и снижает концентрацию ионизированного кальция, а ацидоз, напротив, снижает связывание и увеличивает концентрацию. При первичном гиперпаратиреоидизме концентрация свободного кальция в крови повышается, в то время как уровень общего кальция остается неизменным. Уровень кальция повышен у больных с онкопатологией, у пациентов, находящихся на диализе. Во время беременности содержание общего кальция сыворотки уменьшается параллельно снижению концентрации альбумина, хотя уровень свободного кальция остается в пределах нормы. Значительное повышение уровня Cl- крови может вызвать обезвоживание, острая почечная недостаточность (при анурии, олигурии), несахарный диабет, алкалоз, повышенная функция коры надпочечников. Нехватка хлора в крови организма может быть связана с приемом слабительных, промыванием желудка, увеличением объема жидкости, а также развиться на фоне усиленного потоотделения (секреторные дисфункции и гормональный дисбаланс) или неукротимой рвоты. При ацидозе гипохлоремия связана с повышенным выведением хлора почками с мочой. Также снижение уровня Cl- в крови вызывает передозировка диуретиков, почечная недостаточность (при полиурии), травмы головы. Нарушение обмена хлора ведет к развитию отеков, недостаточной секреции желудочного сока. Резкое уменьшение содержания хлора в организме может привести к тяжелому состоянию, вплоть до комы со смертельным исходом. Внимание! Интерпретировать результаты анализа должен квалифицированный специалист совместно с клинической картиной и данными других лабораторных исследований.

Стационарный АБЗ Ca-Long CL-1500 в Москве

  • Деловые линии: Москва Север

    Лобненская ул., 18

  • Деловые линии: Москва Запад

    Рябиновая ул, 37, стр 1

  • Деловые линии: Москва Капотня

    Московская обл, Люберецкий р-н, г. Котельники, Дзержинское ш., 14

  • Деловые линии: Москва Щелковская

    ул. Пермская 1с15

  • Деловые линии: Москва Марьино

    Иловайская ул., 3, стр. 1

  • Деловые линии: Москва Войковская

    ул. Адмирала Макарова, 2, стр. 23

  • Деловые линии: Москва Восток

    Волгоградский пр-кт, 42, корпус 23

  • Деловые линии: Москва Красносельская

    Леснорядский пер., 18, стр. 1

  • Деловые линии: Москва Юг 2

    Подольских Курсантов ул., 17, к. 2

  • Деловые линии: Москва Академический

    ул. Вавилова ул, 9А, стр. 3

  • Деловые линии: Москва Владыкино

    Сигнальный проезд, 16, стр. 27

  • Деловые линии: Москва Лефортово

    1-я Энтузиастов ул., 3

  • Деловые линии: Москва Медведково

    ул. Полярная, 31Гс2

  • Анализы в KDL. Натрий, калий, хлор (Na/K/Cl)

    Натрий, калий и хлор – это минеральные вещества, способные проводить электрический заряд. Они называются электролитами и делятся на катионы (носители положительного заряда) и анионы (носители отрицательного заряда). К катионам относятся калий и натрий, к анионам – хлор и его соединения. В организме электролиты содержатся в виде растворов солей в тканях и межклеточной жидкости. Некоторое их количество циркулирует в крови. Эти вещества способствуют обменным процессам организма, играют роль в поддержании водного баланса и уровня pH (кислотно-щелочной баланс).

    Калий жизненно важен для клеточного метаболизма - он помогает транспортировать питательные вещества внутрь клетки и выводить из нее отходы, передает нервно-мышечные импульсы и участвует в работе сердечной мышцы. Он присутствует во всех жидкостях организма, но большая часть калия находится в клетках. Лишь небольшое его количество присутствует в крови.

    Обычно калий поступает с пищей в достаточном количестве и выводится почками. Уровень калия жестко регулируется организмом при помощи гормона альдостерона, поскольку даже незначительные колебания содержания калия могут иметь значительные последствия для здоровья – такие, как шок, дыхательная и сердечная недостаточность, аритмия и остановка сердца. При электролитном дисбалансе возникает смещение pH организма в кислую (ацидоз) или щелочную (алкалоз) сторону, что приводит к угрожающим для жизни последствиям и требует незамедлительного лечения.

    Натрий в основном содержится в жидкостях организма, и обеспечивает такие функции, как поддержание внеклеточного осмотического давления, проведение нервно-мышечных импульсов и участие в клеточном обмене. Значительное количество натрия циркулирует в крови. Как и калий, он поступает в организм с пищей из большинства продуктов, а также из поваренной соли. Организм регулирует уровень натрия в определенном диапазоне, а излишки выводит с помощью почек. Гормоны, такие как альдостерон и натрийуретический пептид, могут замедлить или ускорить выведение натрия с мочой.

    Избыток уровня натрия, в том числе в результате его чрезмерного потребления (злоупотребление солью и солеными продуктами) приводит к повышению артериального давления, обезвоживанию, повышенной нагрузке на почки, сухости глаз и кожных покровов. При недостатке натрия вода задерживается в организме за счет действия гормона вазопрессина, что приводит к отекам, в особенности нижних конечностей, застойным явлениям и сердечной недостаточности.

    Хлор - отрицательно заряженный ион, который совместно с калием и натрием помогает регулировать количество жидкости в организме и поддерживать кислотно-щелочной баланс. Он присутствует во всех жидкостях организма, но больше всего хлора содержится в крови и внеклеточной жидкости. Обычно концентрация хлора отражает уровень натрия и изменяется прямо пропорционально его изменениям. Однако при нарушениях pH уровень хлоридов в крови может изменяться независимо от уровня натрия, поскольку хлор действует как буфер. Таким образом он помогает поддерживать нейтральный pH в клетках, перемещаясь внутрь клеток или наружу по необходимости. Хлор поступает в организм с пищей и поваренной солью, его избыток выводится с мочой.

    В каких случаях обычно назначают исследование?

    • Как часть биохимического комплекса общего медицинского обследования;
    • При диагностике дисбаланса pH (ацидоз, алкалоз) и для контроля эффективности его лечения;
    • При таких жалобах, как аритмия, слабость, тошнота, отеки, помутнение сознания;
    • Для контроля за эффективностью лечения заболеваний печени, почек, сердечной недостаточности;
    • При обследовании пациентов с острыми и хроническими заболеваниями.

    Что именно определяется в процессе анализа?

    Происходит измерение концентрации электролитов в образце сыворотки крови пациента с помощью ионселективного метода.

    Что означают результаты теста?

    Концентрация электролитов в крови зависит от их поступления с пищей, содержания воды в организме и работы почек. Кроме того, влияние оказывают гормоны, такие как альдостерон (усиливает выведение калия и поддерживает уровень натрия) и натрийуретический пептид (ускоряет выведение натрия с мочой).

    При нарушениях работы почек организм удерживает воду для разбавления натрия и хлора, что приводит к падению их концентрации ниже нормы. При обезвоживании концентрация электролитов наоборот может возрастать. Влияют на уровень калия, натрия и хлора сердечно-сосудистые и мышечные заболевания, сахарный диабет и патологии нервной системы.

    Любые отклонения уровня электролитов от нормы, особенно калия, очень опасны для жизни и здоровья пациента, и могут быстро привести к серьезным нарушениям в работе сердца и даже к смерти. Поэтому в случае выявления отклонений необходимо как можно быстрее госпитализировать и обследовать пациента.

    Сроки выполнения теста.

    Обычно результат анализа можно получить на следующий день после взятия крови.

    Как подготовиться к анализу?

    Следует придерживаться общих правил подготовки к взятию крови из вены. С подробной информацией можно ознакомиться в соответствующем разделе статьи.

    Кальций (Са2+), Натрий (Na+), Калий (К+), Хлор (Cl-)

    Метод исследования

    • Ионообменная хроматография

    В организме присутствует большое число химических элементов, среди которых особое место занимают электролиты. Они присутствуют в тканях и внеклеточных жидкостях в виде свободных ионов (катионов и анионов). Ионы определяют постоянство ионного состава биологической среды организма.

    Кальций (Ca2+). В сыворотке крови 50% кальция присутствует в свободной (ионизированной) форме (Са2+), 40% кальция циркулирует в комплексе с белками, 9% в виде солей. Именно свободный кальций является регулятором внутриклеточных процессов, измерение уровня ионизированного кальция параллельно с определением уровня общего кальция дает более полную диагностическую информацию.

    Натрий (Na+) - основной катион внеклеточной жидкости. Изменение соотношения Na во внеклеточном и внутриклеточном пространстве определяет изменение осмотического давления, развитие отеков и обезвоживания. Натрий необходим для проведения нервных импульсов и образования костной ткани, обладает рядом регуляторных влияний. Баланс натрия зависит главным образом от нормальной функции почек, секреции альдостерона корой надпочечников, функционирования желудочно-кишечного тракта.

    Калий+) - основной катион внутриклеточной жидкости, в крови содержится не более 2% от общего количества калия. Концентрация К в крови тесно связана с состоянием кровообращения и кислотно-щелочного равновесия. Наиболее частая причина гипокалиемии - повышенная потеря К почками. Гиперкалиемия может развиваться в случаях увеличения поступления или снижения выведения К, а также несоблюдения условий взятия крови.

    Хлор (Cl-) - основной анион внеклеточной жидкости, играет важную роль в поддержании кислотно-основного состояния, осмотического равновесия плазмы крови, лимфы, спинномозговой жидкости и некоторых тканей, баланса воды в организме, является компонентом желудочного сока. Ионы хлора формируют мембранный потенциал клеток, активизируют ряд ферментов. При потере хлоридов развивается алкалоз, при избыточном потреблении - ацидоз. Содержание хлора в организме зависит от баланса поступления хлора с пищей; распределения в тканях и жидкостях организма и выведения с мочой.

    Показания к исследованию:

    Кальций (Ca2+)

    • Оценка содержания кальция в организме 
    • Диагностика заболеваний желудочно-кишечного тракта
    • Включая язвенные заболевания желудка и 12-перстной кишки 
    • Диагностика заболеваний почек 
    • Диагностика остеопороза 
    • Диагностика злокачественных заболеваний

    Натрий (Na+)

    • Нарушение водно-электроитного баланса 
    • Диагностика заболеваний почек

    Хлор (Cl-)

    • Диагностика сердечно-сосудистых заболеванпий
    • Диагностика заболеваний щитовидной железы
    • Диагностика заболеваний почек и надпочечников.

    Кальция хлорид инструкция по применению: показания, противопоказания, побочное действие – описание Calcium chloride р-р д/в/в введения 1 г/10 мл: амп. 10 шт. (8953)

    Кальция хлорид

    💊 Состав препарата Кальция хлорид

    ✅ Применение препарата Кальция хлорид


    Сохраните у себя

    Поделиться с друзьями

    Пожалуйста, заполните поля e-mail адресов и убедитесь в их правильности

    Описание активных компонентов препарата Кальция хлорид (Calcium chloride)

    Приведенная научная информация является обобщающей и не может быть использована для принятия решения о возможности применения конкретного лекарственного препарата.

    Дата обновления: 2020.11.08

    Владелец регистрационного удостоверения:

    Код ATX: B05XA07 (Calcium chloride)

    Лекарственная форма


    Кальция хлорид

    Р-р д/в/в введения 1 г/10 мл: амп. 10 шт.

    рег. №: ЛС-000366 от 09.04.10 - Бессрочно

    Форма выпуска, упаковка и состав препарата Кальция хлорид


    Раствор для в/в введения1 мл1 амп.
    кальция хлорид100 мг1 г

    10 мл - ампулы (10) - пачки картонные.

    Фармакологическое действие

    Кальций - макроэлемент, участвующий в формировании костной ткани, процессе свертывания крови, необходим для поддержания стабильной сердечной деятельности, процессов передачи нервных импульсов. Улучшает сокращение мышц при мышечной дистрофии, миастении, уменьшает проницаемость сосудов, оказывает противоаллергическое действие. При в/в введении кальций вызывает возбуждение симпатической нервной системы и усиление выделения надпочечниками адреналина; оказывает умеренное диуретическое действие.

    При взаимодействии раствора кальция хлорида с солями магния, щавелевой и фтористой кислотами образуются нерастворимые соединения, что позволяет применять раствор кальция хлорида в качестве антидота.

    Фармакокинетика

    В крови кальций находится в ионизированном и в связанном состоянии. В плазме около 45% кальция находится в комплексе с белками. Физиологической активностью обладает ионизированный кальций. Депонируется в костной ткани. Около 20% выводится почками, остальное количество (80%) - кишечником. 95% кальция, выводящегося путем гломерулярной фильтрации, подвергается резорбции в восходящем сегменте петли Генле, а также в проксимальных и дистальных почечных канальцах.

    Показания активных веществ препарата Кальция хлорид

    Аллергические заболевания (крапивница, ангионевротический отек, аллергодерматозы, сывороточная болезнь), гипокальциемия (в т.ч. гипокальциемическая тетания, при гипопаратиреозе), свинцовая колика, гиперкалиемия, передозировка солями магния (в составе комплексной терапии).

    Режим дозирования

    Способ применения и режим дозирования конкретного препарата зависят от его формы выпуска и других факторов. Оптимальный режим дозирования определяет врач. Следует строго соблюдать соответствие используемой лекарственной формы конкретного препарата показаниям к применению и режиму дозирования.

    Применяют внутрь, в/в струйно или капельно. Дозу, способ и схему применения, длительность терапии определяют индивидуально, в зависимости от показаний, клинической ситуации и возраста пациента.

    Дозу для детей устанавливают из расчета на массу тела.

    Побочное действие

    Возможно: ощущение жара сначала в полости рта, а затем по всему телу, привкус мела во рту, периферическая вазодилатация, снижение АД, аритмия (в т.ч. брадикардия), тошнота, обморок. При попадании в подкожную клетчатку и в мышцу вызывает сильное раздражение и некроз окружающих тканей. При быстром в/в введении возможны фибрилляция желудочков сердца, сердечно-сосудистая недостаточность, вплоть до остановки сердца.

    Местные реакции: раздражение по ходу вены; гиперемия кожи, боль, сыпь, кальцификация могут свидетельствовать об экстравазации, которая может приводить к некрозу окружающих тканей.

    Противопоказания к применению

    Повышенная чувствительность к кальция хлориду, гиперкальциемия, тяжелая хроническая почечная недостаточность, фибрилляция желудочков, мочекаменная болезнь, саркоидоз, выраженный атеросклероз, склонность к тромбообразованию, одновременный прием с сердечными гликозидами; беременность; период грудного вскармливания.

    С осторожностью: хроническая почечная недостаточность легкой и средней степени тяжести, дегидратация, нарушение электролитного баланса (риск гиперкальциемии), заболевания сердца (риск аритмии), заболевания почек, «легочное» сердце, респираторный ацидоз, дыхательная недостаточность (риск токсических реакций вследствие окисления кальция), детский возраст.

    Применение при беременности и кормлении грудью

    Противопоказан к применению при беременности и в период лактации (грудного вскармливания). При необходимости применения в период лактации следует решить вопрос о прекращении грудного вскармливания.

    Применение при нарушениях функции почек

    Противопоказано применение при тяжелой хронической почечной недостаточности. С осторожностью применять при хронической почечной недостаточности легкой и средней степени тяжести, заболеваниях почек.

    Применение у детей

    Кальция хлорид следует с осторожностью применять у детей.

    Особые указания

    Не вводить п/к и в/м. При попадании кальция хлорида под кожу или в мышечные ткани развивается сильное раздражение с образованием очагов некроза.

    При возникновении боли или гиперемии в месте введения следует прекратить введение и исключить экстравазацию средства.

    Лечение проводят под контролем концентрации кальция в крови.

    При аллергических заболеваниях рекомендуется совместное применение кальция хлорида и антигистаминных препаратов.

    Влияние на способность к управлению транспортными средствами и механизмами

    В период лечения в связи с возможным развитием побочных эффектов необходимо соблюдать осторожность при вождении автотранспорта и занятиях другой деятельностью, требующей высокой концентрации внимания и скорости психомоторных реакций.

    Лекарственное взаимодействие

    При одновременном применении уменьшает действие блокаторов "медленных" кальциевых каналов; с другими кальций- и магнийсодержащими препаратами повышается риск гиперкальциемии или гипермагниемии соответственно, особенно у пациентов с хронической почечной недостаточностью; с хинидином - возможно замедление внутрижелудочковой проводимости и повышение токсичности хинидина.

    Снижает эффективность недеполяризующих миорелаксантов. Может увеличивать продолжительность действия тубокурарина хлорида.

    Фармацевтически несовместим с тетрациклинами, магния сульфатом, лекарственными препаратами, содержащими фосфаты, карбонаты или тартраты.

    Кальция хлорид несовместим с солями свинца, серебра, одновалентной ртути вследствие образования нерастворимых хлоридов тяжелых металлов и с барбиталом натрия, т.к. при этом образуется малорастворимая кальциевая соль барбитала.

    Во время лечения сердечными гликозидами парентеральное применение кальция хлорида не рекомендуется в связи с усилением кардиотоксического действия.


    Сохраните у себя

    Поделиться с друзьями

    Пожалуйста, заполните поля e-mail адресов и убедитесь в их правильности

    E83.5 - Нарушения обмена кальция

    Акласта®

    Р-р д/инф. 5 мг/100 мл: фл. 1 шт.

    рег. №: ЛС-002514 от 21.10.11 Дата перерегистрации: 24.05.18
    Бонефос®

    Капс. 400 мг: 100 шт.

    рег. №: П N014659/02 от 14.05.09 Дата перерегистрации: 25.03.13
    BAYER (Финляндия)
    Бонефос®

    Таб., покр. пленочной оболочкой, 800 мг: 60 шт.

    рег. №: П N014659/01 от 26.05.09 Дата перерегистрации: 03.10.13
    BAYER (Финляндия)
    Верокласт

    Концентрат д/пригот. р-ра д/инф. 0.8 мг/мл: 5 мл фл. 1, 50 или 80 шт.

    рег. №: ЛСР-006249/10 от 01.07.10
    Верокласт

    Лиофилизат д/пригот. р-ра д/инф. 4 мг: фл. 1 шт. в компл. с растворителем

    рег. №: ЛСР-002910/10 от 07.04.10
    Виванат Ромфарм

    Р-р д/в/в введения 1 мг/1 мл: шприцы 3 мл 1 или 4 шт.

    рег. №: ЛП-004525 от 31.10.17
    Гидрокортизон

    Сусп. д/в/м и внутрисуставного введения 25 мг/1 мл: амп. 5 или 10 шт.

    рег. №: П N016113/01 от 16.10.09
    Гидрокортизон

    Сусп. д/в/м и внутрисуставного введения 50 мг/2 мл: амп. 5 или 10 шт.

    рег. №: П N016113/01 от 16.10.09
    Гидрохлоротиазид

    Таб. 100 мг: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 80 или 100 шт.

    рег. №: ЛС-000726 от 21.06.10
    Гидрохлоротиазид

    Таб. 100 мг: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 120 или 200 шт.

    рег. №: ЛП-002767 от 17.12.14
    Произведено: ОЗОН (Россия)
    Гидрохлоротиазид

    Таб. 25 мг: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 80 или 100 шт.

    рег. №: ЛС-000726 от 21.06.10
    Гидрохлоротиазид

    Таб. 25 мг: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 120 или 200 шт.

    рег. №: ЛП-002767 от 17.12.14
    Произведено: ОЗОН (Россия)
    Гидрохлортиазид

    Таб. 100 мг: 20 шт.

    рег. №: Р N001621/01 от 31.08.07
    Гидрохлортиазид

    Таб. 25 мг: 10, 14, 20, 21, 28, 30, 40 или 50 шт.

    рег. №: ЛП-004823 от 24.04.18

    Таб. 100 мг: 10, 14, 20, 21, 28, 30, 40 или 50 шт.

    рег. №: ЛП-004823 от 24.04.18
    Гидрохлортиазид

    Таб. 25 мг: 20 шт.

    рег. №: Р N001621/01 от 31.08.07
    Гидрохлортиазид

    Таб. 25 мг: 20 шт.

    рег. №: ЛП-006513 от 16.10.20
    Гидрохлортиазид-Сар

    Таб. 25 мг: 50 шт.

    рег. №: Р N003748/01 от 02.10.09
    Гипотиазид®

    Таблетки

    рег. №: ЛП-№(000114)-(РГ-R U от 15.01.21 Предыдущий рег. №: П N013510/01
    Гипотиазид®

    Таблетки

    рег. №: ЛП-№(000114)-(РГ-R U) от 15.01.21 Предыдущий рег. №: П N013510/01
    Дигидротахистерол

    Р-р д/приема внутрь в масле 0.1% (1 мг/1 мл): фл.-капельн. 10 мл, 15 мл, 20 мл или 30 мл, фл. 10 мл, 15 мл, 20 мл или 30 мл

    рег. №: Р N001527/01 от 06.10.08
    Золедроновая кислота

    Концентрат д/пригот. р-ра д/инф. 0.8 мг/мл: 5 мл или 6.25 мл фл. 1 или 5 шт.

    рег. №: ЛП-006082 от 06.02.20
    Золедроновая кислота

    Концентрат д/пригот. р-ра д/инф. 4 мг/5 мл: фл. 1 шт.

    рег. №: ЛП-003688 от 20.06.16 Дата перерегистрации: 27.04.17
    Золедроновая кислота

    Концентрат д/пригот. р-ра д/инф. 4 мг/5 мл: фл. 1 шт.

    рег. №: ЛП-006151 от 17.03.20
    Золедроновая кислота

    Лиофилизат д/пригот. конц. д/пригот. р-ра д/инф. 4 мг: фл. 1 шт.

    рег. №: ЛП-005335 от 05.02.19
    Золедроновая кислота-Ферейн®

    Концентрат д/пригот. р-ра д/инф. 4 мг/5 мл: амп. или фл. 1, 5 или 10 шт.

    рег. №: ЛП-007061 от 02.06.2021
    Золедрэкс

    Лиофилизат д/пригот. р-ра д/инф. 4 мг: фл.

    рег. №: ЛП-001476 от 06.02.12

    E87.5 - Гиперкалиемия - список препаратов нозологической группы в справочнике МКБ-10

    Дисоль

    Р-р д/инф. 6 г+2 г/1 л: бут. 100 мл, 200 мл, 250 мл, 400 мл или 500 мл

    рег. №: Р N001118/01 от 22.12.11
    Дисоль

    Р-р д/инф. 6 г+2 г/1 л: бут. 100мл, 200 мл, 400 мл, 2400 мл, 2800 мл, 4800 мл, 5600 мл, 6000 мл, 7500 мл, 12000 мл.

    рег. №: Р N002024/01-2002 от 04.04.08
    Дисоль

    Р-р д/инф. 6 г+2 г/1 л: бут. 200 мл, 400 мл

    рег. №: П N015753/01 от 14.05.09
    Дисоль

    Р-р д/инф. 6 г+2 г/1 л: бут. 200 мл, 400 мл

    рег. №: Р N003712/01 от 18.05.09
    Дисоль

    Р-р д/инф. 6 г+2 г/1 л: бут. 200 мл, 400 мл

    рег. №: ЛС-002276 от 13.04.12
    Дисоль

    Р-р д/инф. 6 г+2 г/1 л: бут. 200 мл, 400 мл

    рег. №: ЛСР-001924/08 от 18.03.08
    Дисоль

    Р-р д/инф. 6 г+2 г/1 л: фл. 200 мл или 400 мл

    рег. №: Р N001951/01 от 07.12.07
    Дисоль

    Р-р д/инф. 6 г+2 г/1 л: фл. 200 мл, 400 мл

    рег. №: Р N003878/01 от 09.11.09
    Дисоль

    Р-р д/инф. 6 г+2 г/л: 100 мл, 200 мл, 250 мл, 400 мл, 500 мл или 1000 мл фл.

    рег. №: ЛП-002713 от 14.11.14
    Калимейт

    Порошок д/пригот. сусп. д/приема внутрь 1 г: пак. 5 г 21 шт.

    рег. №: ЛП-003329 от 24.11.15 Дата перерегистрации: 28.10.16
    Кальция хлорид

    Р-р д/в/в введения 1 г/10 мл: амп. 10 шт.

    рег. №: Р N002915/01 от 15.12.08
    Кальция хлорид

    Р-р д/в/в введения 1 г/10 мл: амп. 10 шт.

    рег. №: ЛС-000366 от 09.04.10
    Кальция хлорид

    Р-р д/в/в введения 1 г/10 мл: амп. 10 шт.

    рег. №: ЛС-002097 от 07.10.11
    Кальция хлорид

    Р-р д/в/в введения 1 г/10 мл: амп. 10 шт.

    рег. №: ЛСР-001497/08 от 14.03.08
    Кальция хлорид

    Р-р д/в/в введения 1 г/10 мл: амп. 10 шт.

    рег. №: ЛСР-007953/08 от 08.10.08
    Кальция хлорид

    Р-р д/в/в введения 1 г/10 мл: амп. 5 или 10 шт.

    рег. №: ЛСР-006661/08 от 15.08.08
    Кальция хлорид

    Р-р д/в/в введения 100 мг/1 мл: амп. 5 или 10 шт.

    рег. №: ЛП-003361 от 09.12.15
    Произведено: ОЗОН (Россия)
    Кальция хлорид

    Р-р д/в/в введения 100 мг/мл: 5 мл или 10 мл амп. 10 шт.

    рег. №: ЛС-000510 от 06.05.10
    Кальция хлорид

    Р-р д/в/в введения 100 мг/мл: 5 мл или 10 мл амп. 5 или 10 шт.

    рег. №: ЛП-002060 от 25.04.13
    Кальция хлорид

    Р-р д/в/в введения 100 мг/мл: амп. 5 или 10 шт.

    рег. №: Р N003215/01 от 22.12.10
    Кальция хлорид

    Р-р д/в/в введения 200 мг/2 мл: амп. 10 шт.

    рег. №: Р N002915/01 от 15.12.08
    Кальция хлорид

    Р-р д/в/в введения 200 мг/2 мл: амп. 10 шт.

    рег. №: ЛС-002097 от 07.10.11
    Кальция хлорид

    Р-р д/в/в введения 500 мг/5 мл: амп. 10 шт.

    рег. №: Р N002915/01 от 15.12.08
    Кальция хлорид

    Р-р д/в/в введения 500 мг/5 мл: амп. 10 шт.

    рег. №: ЛС-002097 от 07.10.11
    Кальция хлорид

    Р-р д/в/в введения 500 мг/5 мл: амп. 10 шт.

    рег. №: ЛСР-001497/08 от 14.03.08
    Кальция хлорид

    Р-р д/в/в введения 500 мг/5 мл: амп. 10 шт.

    рег. №: ЛСР-007953/08 от 08.10.08
    Кальция хлорид

    Р-р д/в/в введения 500 мг/5 мл: амп. 5 или 10 шт.

    рег. №: ЛСР-006661/08 от 15.08.08
    Локелма

    Порошок д/пригот. суспензии д/приема внутрь 5 г: 30 шт.

    рег. №: ЛП-006086 от 07.02.20

    Порошок д/пригот. суспензии д/приема внутрь 10 г: 30 шт.

    рег. №: ЛП-006086 от 07.02.20
    Сорбистерит

    Порошок д/пригот. сусп. д/приема внутрь и рект. введения: 500 г банки

    рег. №: ЛП-001334 от 08.12.11 Дата перерегистрации: 30.03.17

    границ | Ca2 + -зависимость регулируемых по объему VRAC / LRRC8 и TMEM16A Cl– каналов

    Введение

    Набухание клеток активирует токи Cl - (I Cl , набухание ), которые известны как регулируемые анионные каналы объема - (VRAC) (Jentsch, 2016; Pedersen et al., 2016; Strange et al., 2019). VRAC теперь идентифицируется как LRRC8 / SWELL1 (Qiu et al., 2014; Voss et al., 2014). Его гексамерная структура описана в четырех независимых крио-ЭМ исследованиях (Deneka et al., 2018; Kasuya et al., 2018; Kefauver et al., 2018; Kern et al., 2019). Существенная субъединица LRRC8A вместе с вариабельной комбинацией дополнительных четырех паралоговых белков LRRC8B-E образует гетеромеры с различными кинетическими свойствами. Многочисленные исследования показывают вклад этих каналов в устойчивость клеток к цисплатину и другим противораковым препаратам (Ise et al., 2005; Mahmud et al., 2008; Planells-Cases et al., 2015) и, возможно, к росту рака (Lemonnier et al. ., 2004; Kunzelmann et al., 2019; Liu, Stauber, 2019; Lu et al., 2019). Другие сообщили о роли VRAC в апоптотической гибели клеток (Gulbins et al., 2000; Okada et al., 2006; Wanitchakool et al., 2016). Несмотря на структурную информацию, механизм активации каналов VRAC / LRRC8 остается не совсем понятным. Хотя снижение внутриклеточной ионной силы является важным предварительным условием (Cannon et al., 1998; Sabirov et al., 2000; Syeda et al., 2016), внутриклеточный Ca 2+ оказался важным для активации I Cl . , набухание и для регулирования клеточного объема (Mccarty and O'neil, 1992; Lemonnier et al., 2002; Акита и др., 2011; Бенедетто и др., 2016; Лю и др., 2019).

    Набухание клеток активирует не только VRAC / LRRC8, но и Ca 2+ -зависимый TMEM16A (Almaca et al., 2009; Benedetto et al., 2016; Liu et al., 2019) и каналы / скрамблазы TMEM16F (Juul et al. ., 2014; Сирианант и др., 2016а). Наши более ранние результаты показывают, что как TMEM16A, так и LRRC8 вносят вклад в I Cl , набухание (Benedetto et al., 2016) в зависимости от Ca 2+ . Это было показано также для индуцированной сывороткой активации тока (Zhang et al., 2020). Фактически, мы продемонстрировали, что LRRC8 не важен для I Cl , набухания или регуляции клеточного объема (Milenkovic et al., 2015; Sirianant et al., 2016b). В частности, в дифференцированных наивных клетках в тканях и в эпителиальных клетках с большой транспортной способностью физиологическое значение LRRC8 может быть ограничено (Almaca et al., 2009; Milenkovic et al., 2015; Sirianant et al., 2016b).

    Предыдущие исследования не дали ответа на вопрос, активируются ли LRRC8 и TMEM16A / F параллельно, чтобы вызвать I Cl , набухание , или же белки TMEM16, в частности TMEM16A, поддерживают активацию LRRC8, способствуя Ca 2+ сигналы вблизи плазматической мембраны (Benedetto et al., 2016; Cabrita et al., 2017). Для сравнения, такой Ca 2+ -модулирующий эффект TMEM16A является фундаментальным для активации CFTR, как было продемонстрировано in vitro и in vivo у мыши и человека (Von Kleist et al., 1975; Benedetto et al., 2017, 2019b; Park et al., 2020), которые эндогенно экспрессируют оба белка. Эти данные свидетельствуют о том, что TMEM16A поддерживает высвобождение Ca 2+ из эндоплазматического ретикулума (ER) и вызывает приток Ca 2+ , который активирует TMEM16A и поддерживает активацию LRRC8.

    Материалы и методы

    Культура клеток

    Все клетки выращивали при 37 ° C в увлажненной атмосфере с 5% (об. / Об.) CO 2 . Эмбриональные клетки почек человека HEK293T (Simmons, 1990), стабильно экспрессирующие йодид-чувствительный усиленный желтый флуоресцентный белок (eYFP-I152L; HEK-YFP; Amgen, Thousand Oaks, Калифорния, США), выращивали в среде с низким содержанием глюкозы DMEM с добавлением 10% (об. / об.) фетальная бычья сыворотка (FBS), 1% (об. / об.) L-глутамин 200 мМ и 10 мМ HEPES (все от Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Германия) в присутствии селективного антибиотика пуромицина 0.5 мкг / мл (Sigma-Aldrich, Миссури, США). Клетки, стабильно коэкспрессирующие TMEM16A (HEK-YFP-TMEM16A), культивировали с дополнительным гигромицином B (150 мкг / мл; Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Германия). Эпителиальные клетки карциномы толстой кишки человека HT29, стабильно экспрессирующие eYFP-I152L (HT29-YFP, любезно предоставленные профессором Луисом Галиеттой, TIGEM, Поццуоли, и профессором Николеттой Педемонте, Институт Джаннины Гаслини, Генуя, Италия), культивировали в среде Маккоя с добавками 5A. с 10% (об. / об.) FBS и селективным антибиотиком G418 1 мг / мл (все от Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Германия).

    ОТ-ПЦР, миРНК и кДНК

    Человеческих LRRC8A (NM_00127244.1) и LRRC8C (NM_032270.5) были субклонированы в бицистронный вектор pIRES2 (Clontech Laboratories / Takara Bio United States, Mountain View, California, United States) с использованием стандартных методов. Конструкция была проверена секвенированием (Microsynth Seqlab, Геттинген, Германия). Трансфекцию кДНК в клетки HEK293T проводили с использованием стандартных протоколов для Lipofectamine 3000 (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США).КДНК CD8 котрансфицировали, чтобы сделать возможным обнаружение сверхэкспрессирующих клеток путем связывания гранул, меченных анти-CD8 (Dynabeads ® M-450 Epoxy; Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США). Нокдаун TMEM16A и LRRC8A в клетках HT29 проводили посредством трансфекции путем электропорации siRNA siTMEM16A (5-GGUUCCCAG CCUACCUCACUAACUU-3, Invitrogen, Carlsbad, California, United States) и / или siLRRCAUCAUCAUCCI, , Техас, США), используя систему трансфекции неона (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США) с программой из трех импульсов, 1650 В и 10 мс.Скремблированную миРНК (Silencer ® Select Negative Control siRNA # 1, Ambion, Austin, Texas, United States) трансфицировали в качестве отрицательного контроля. Все эксперименты проводили через 48–72 ч после трансфекции.

    Вестерн-блоттинг

    Белок был выделен из клеток с использованием лизирующего буфера, содержащего 25 мМ Трис-HCl pH 7,4, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 5% глицерин, 0,43% Nonidet P-40, 100 мМ дитиотреитол (оба от PanReac AppliChem, Барселона, Испания). ) и смесью 1х ингибиторов протеаз (Roche, Базель, Швейцария).Затем белки разделяли с помощью 8,5% SDS-PAGE и переносили на PVDF-мембрану (GE Healthcare, Мюнхен, Германия). Мембраны инкубировали с первичными кроличьими моноклональными антителами против TMEM16A / DOG1 (# NBP1-49799; Novus Biologicals, Литтлтон, Колорадо, США; 1: 500 в 1% (мас. / Об.) NFM / TBS-T) или кроличьими поликлональными антителами. -LRRC8A-антитело (# HPA016811; Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США; 1: 1000 в 1% (мас. / Об.) BSA / TBS-T) в течение 2,5 ч при комнатной температуре. Кроличьи поликлональные антитела против β-актина (A2066; Sigma-Aldrich, St.Луис, штат Миссури, США; 1: 10000 в 5% (мас. / Об.) NFM / TBS-T) использовали для контроля загрузки. Затем мембраны инкубировали с конъюгированными с пероксидазой хрена (HRP) козьими поликлональными вторичными антителами против кроликов (# 31460; Invitrogen, Carlsbad, California, United States) при комнатной температуре в течение 2 часов, и иммунореактивные сигналы визуализировали с использованием набора для обнаружения хемилюминесцентных субстратов SuperSignal. (# 34577; Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США).

    Зажимной патч

    Клетки фиксировали пластырем на покровных стеклах.Если не указано иное, патч-пипетки заполняли цитозольным раствором, содержащим (мМ) KCl 30, K-глюконат 95, Nah3PO4 1,2, Na2HPO4 4,8, EGTA 1, Ca-глюконат 0,758, MgCl2 1,03, D-глюкозу 5, АТФ. 3; 290 мосм / л; pH 7,2. Концентрация свободного Ca 2+ (активность Ca 2+ ) составляла 0,1 мкМ. Чтобы довести концентрацию Ca 2+ в пипетке до 0,01 мкМ, раствор для заполнения пипетки содержал (мМ) KCl 30, K-глюконат 95, Nah3PO4 1,2, Na2HPO4 4,8, EGTA 1, Ca-глюконат 0,209, MgCl2 1.03, D-глюкоза 5 и АТФ 3; 290 мосм / л; pH 7,2. Концентрации свободного Ca 2+ рассчитывались по программе, разработанной в Институте биофизики им. Макса Планка (Франкфурт, Германия). Активности Ca 2+ (концентрации свободного Ca 2+ ) были первоначально подтверждены потенциометрическим определением с использованием Ca 2+ -чувствительных электродов. В некоторых экспериментах патч-пипетки заполняли буфером CsCl, содержащим (мМ) CsCl 125, Nah3PO4 1,2, Na2HPO4 4,8, EGTA 1, Ca-глюконат 0.209, MgCl2 1,03, D-глюкоза 5 и АТФ 3; pH 7,2. В этих экспериментах в качестве раствора для ванны использовали буфер CsCl, содержащий 145 CsCl, 0,4 Kh3PO4, 1,6 K2HPO, 4,6 D-глюкозы, 1 MgCl2 и 1,3 Ca 2+ глюконат, 290 мосм / л; pH 7,4.

    Покровные стекла помещали в камеру перфузируемой ванны на предметном столике инвертированного микроскопа (IM35, Zeiss) и хранили при 37 ° C. Баню непрерывно перфузировали раствором Рингера со скоростью 8 мл / мин. Для активации зависящих от объема токов Cl - используйте изотонический раствор ванны Рингера (300 мосм / л; мМ: 145 NaCl, 0.4 Kh3PO4, 1,6 K2HPO, 4,6 D-глюкозы, 1 MgCl2, 1,3 Ca 2+ глюконат, pH 7,4) заменяли на раствор гипотонической ванны (Hypo; 200 мосм / л) путем удаления 50 мМ NaCl из раствора Рингера. Эксперименты "патч-зажим" проводили в быстрой цельноклеточной конфигурации. Пипетки-патчи имели входное сопротивление 4–6 МОм при заполнении цитозольным (физиологическим) раствором. Токи были скорректированы на последовательное сопротивление. Проводимость доступа измерялась непрерывно и составляла 60–140 нСм. Токи (токовые клещи) и напряжения (токовые клещи) регистрировались с помощью усилителя с коммутационным зажимом (EPC 7, List Medical Electronics, Дармштадт, Германия), интерфейса LIh2600 и программного обеспечения PULSE (HEKA, Lambrecht, Германия), а также Chart программное обеспечение (AD Instruments, Spechbach, Германия).Данные непрерывно сохранялись на жестком диске компьютера и анализировались с помощью программного обеспечения PULSE. Через равные промежутки времени напряжение мембраны (Vc) было ограничено с шагом 20 мВ от -100 до +100 мВ от удерживающего напряжения -100 мВ. Плотность тока рассчитывалась делением токов всей ячейки на емкость ячейки.

    Закалка YFP

    Тушение внутриклеточной флуоресценции, генерируемой стабильной трансфекцией чувствительного к йодиду (I - ) усиленного желтого флуоресцентного белка (eYFP-I152L), использовали для измерения анионной проводимости.Флуоресценцию YFP возбуждали на длине волны 490 нм с использованием высокоскоростной полихроматической системы освещения для микроскопических измерений флуоресценции (Visitron Systems, Пуххайм, Германия), а испускаемый свет на длине волны 535 ± 25 нм регистрировали с помощью CCD-камеры CoolSnap HQ (Roper Scientific, Planegg). , Германия / Visitron Systems, Пуххайм, Германия). Клетки выращивали на покровных стеклах и помещали в камеру для получения изображений с термостатическим контролем, адаптированную к инвертированному микроскопу (Axiovert S100, Zeiss, Oberkochen, Германия), поддерживали при 37 ° C и перфузировали со скоростью 5 мл / мин.После короткого периода в стандартном растворе Рингера (в мМ: NaCl 145, KH 2 PO 4 0,4, K 2 HPO 4 ⋅ 3 H 2 0 1,6, глюкоза 5, MgCl 2 ⋅ 6 H 2 0 1, Ca-глюконат ⋅ 1 H 2 0 1,3), клетки стимулировали гипотоническим (200 мосм / л) раствором следующего состава (в мМ): NaCl 45, KH 2 PO 4 0,4, K 2 HPO 4 3 H 2 0 1,6, глюкоза 5, MgCl 2 ⋅ 6 H 2 0 1, Ca-глюконат ⋅ 1 H 2 0 1.3, Na-глюконат 50) или изотонический раствор в качестве контроля (в мМ: NaCl 45, KH 2 PO 4 0,4, K 2 HPO 4 ⋅ 3 H 2 0 1,6, глюкоза 5, MgCl 2 6 H 2 0 1, Ca-глюконат ⋅ 1 H 2 0 1,3, Na-глюконат 50, маннитол 100). Тушение флуоресценции YFP за счет притока I - было вызвано заменой 50 мМ внеклеточного глюконата на I - . Управление экспериментом, получение изображений и анализ данных выполнялись с помощью программного пакета MetaFluor (Universal Imaging, Bedford Hills, Нью-Йорк, США).Автофлуоресценция была незначительной. Для количественного анализа отбрасывали клетки с низкой или чрезмерно высокой флуоресценцией. Изменения флуоресценции, вызванные захватом I -, выражаются как начальные скорости максимального уменьшения флуоресценции (а.е. / с).

    В качестве альтернативы измерения гашения YFP проводили на флюоресцентном микропланшет-ридере (NOVOstar, BMG Labtech, Ортенберг, Германия), поддерживаемом при 37 ° C, с использованием длины волны возбуждения 485 нм и детектирования излучения при 520 нм. Клетки помещали в прозрачные 96-луночные планшеты (Sarstedt, Nümbrecht, Германия), культивировали 48–72 ч до 80–90% конфлюэнтности и инкубировали с тестируемыми соединениями или без них в стандартном растворе Рингера (300 мосм / л).После короткого считывания базальной флуоресценции клетки стимулировали гипотоническим (200 мосм / л) раствором (в мМ: NaCl 21,67, NaI 26,67, KH 2 PO 4 0,4, K 2 HPO 4 ⋅ 3 H 2 0 1,6, глюкоза 5, MgCl 2 ⋅ 6 H 2 0 1, Ca-глюконат ⋅ 1 H 2 0 1,3, маннитол 58) добавляется путем автоматической инъекции через шприцевой насос или изотонический раствор (в мМ: NaCl 21,67, NaI 26,67, KH 2 PO 4 0,4, K 2 HPO 4 ⋅ 3 H 2 0 1.6, глюкоза 5, MgCl 2 6 H 2 0 1, Ca-глюконат ⋅ 1 H 2 0 1,3, маннитол 193,3) в качестве контроля. Для стимуляции АТФ клетки инкубировали с тестируемыми соединениями или без них в глюконат-замещенном растворе Рингера (в мМ: NaCl 100, Na-глюконат 40, KCl 5, MgCl 2 ⋅ 6 H 2 0 1, CaCl 2 ⋅ 2 H 2 0 2, глюкоза 10, HEPES 10) и АТФ добавляли в симметричный I - -замещенный раствор Рингера (в мМ: NaCl 100, NaI 40, KCl 5, MgCl 2 ⋅ 6 H 2 0 1, CaCl 2 ⋅ 2 H 2 0 2, D-глюкоза 10, HEPES 10).Конечная концентрация I - в каждой лунке составляла 20 мМ для каждого эксперимента. Интенсивность общей внутриклеточной YFP-флуоресценции в каждой лунке измеряли непрерывно. Фоновую флуоресценцию вычитали, и данные нормализовали по исходной флуоресценции. Затем рассчитывали начальную скорость максимального затухания флуоресценции, вызванного притоком I - , как меру анионной проводимости.

    Ca

    2+ Измерения

    Клетки высевали на покровные стекла и загружали 2 мкМ Fura-2, AM Ester (Biotium, Hayward, California, United States) и 0.02% Pluronic F-127 (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США) в стандартном растворе Рингера (в мМ: NaCl 145, KH 2 PO 4 0,4, K 2 HPO 4 3 H 2 0 1,6, глюкоза 5, MgCl 2 6 H 2 0 1, Ca-глюконат ⋅ 1 H 2 0 1,3) в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем клетки помещали в термостатируемую камеру для визуализации, адаптированную к инвертированному микроскопу (Axiovert S100, Zeiss, Оберкохен, Германия), поддерживали при 37 ° C и перфузировали со скоростью 5 мл.Fura-2 возбуждали на длине волны 340/380 нм с использованием высокоскоростной полихроматической системы освещения для микроскопических измерений флуоресценции (Visitron Systems, Пуххайм, Германия), а излучение регистрировали между 470 и 550 нм с помощью камеры CoolSnap HQ CCD (Roper Scientific, Планегг, Германия / Visitron Systems, Пуххайм, Германия). Клетки стимулировали АТФ или гипотоническим (200 мосм / л) раствором (в мМ: NaCl 95, KH 2 PO 4 0,4, K 2 HPO 4 3 H 2 0 1.6, глюкоза 5, MgCl 2 6 H 2 0 1, Ca-глюконат ⋅ 1 H 2 0 1,3). Внутриклеточный кальций ([Ca 2+ ] i ) рассчитывали из отношения флуоресценции 340/380 нм после вычитания фона по формуле [Ca 2+ ] i = Kd × (R− R min ) / (R max −R) × (S f2 / S b2 ) , где R - наблюдаемый коэффициент флуоресценции.Значения R max и R min (максимальное и минимальное соотношения) и константа S f2 / S b2 (флуоресценция свободных и Ca 2+ -связанный Fura-2 при 380 нм) рассчитывали с использованием 2 мкМ иономицина (Calbiochem, Сан-Диего, Калифорния, США), 5 мкМ нигерицина (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США), 10 мкМ моненсин (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) и 5 ​​мМ EGTA (Carl Roth, Карлсруэ, Германия) для уравновешивания внутриклеточного и внеклеточного Ca 2+ в интактных клетках, нагруженных Fura-2.Константа диссоциации ( Kd ) комплекса Fura-2⋅Ca 2+ была принята равной 224 нМ. Управление экспериментом, получение изображений и анализ данных выполнялись с помощью программного пакета MetaFluor (Universal Imaging, Bedford Hills, Нью-Йорк, США).

    Материалы и статистический анализ

    Suramin, U73122, 2-APB, дантролен и NS3728 были из Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США. Никлозамид, Ani9 и DCPIB были из Токриса, Бристоль, Соединенное Королевство.Ксестоспонгин С и никлозамидэтаноламин были от Cayman Chemical, Ann Arbor, Michigan, United States. Пробенецид был от MP Biomedicals, Ирвин, Калифорния, США. Данные представлены в виде отдельных кривых или сводок со средними значениями ± SEM и количеством экспериментов, указанными в легенде каждого рисунка. Для статистического анализа использовали парный или непарный критерий Стьюдента t соответственно. Значение p <0,05 было принято как статистически значимое различие (обозначено # для непарных данных и * для парных данных).

    Результаты

    Активация эндогенного и сверхэкспрессированного VRAC Ca

    2+ Зависимый

    Более ранние исследования предполагали потребность в Ca 2+ для активации I Cl , набухания и стимуляции эндогенного LRRC8 / Swell1 (Akita and Okada, 2011; Benedetto et al., 2016). Здесь мы непосредственно подтвердили зависимость Ca 2+ токов LRRC8 путем совместной экспрессии LRRC8A и LRRC8C в клетках HEK293 с использованием бицистронной экспрессионной плазмиды.На фигуре 1A показано сильное увеличение экспрессии LRRC8A по сравнению с эндогенной экспрессией LRRC8A (сверхэкспрессия LRRC8C не показана). Сверхэкспрессия LRRC8A / C в значительной степени увеличивала токи целых клеток, активируемых гипотоническим (200 мосм / л) раствором ванны (Hypo) в присутствии внутриклеточной (пипетка, 290 мосм / л) концентрации 100 нМ Ca 2+ . Сверхэкспрессия LRRC8A / C очень быстро активируется гипоиндуцированным набуханием клеток (рис. 1В). Постепенное снижение внутриклеточных (например, патч-пипетка) концентраций Ca 2+ до 10 и до 0 нМ постепенно подавляло гипоактивацию эндогенного I Cl , набухание , а также сверхэкспрессированные токи LRRC8A / C (рисунки 1С, Г).Эксперименты указывают на потребность в Ca 2+ для активации VRAC / LRRC8.

    Рисунок 1. Активация LRRC8A / C зависит от Ca 2+ . (A) Коэкспрессия LRRC8A и LRRC8C бицистронным вектором. Обнаружение LRRC8A вестерн-блоттингом. (B) Непрерывная регистрация токов целых клеток, активируемых гипотоническим набуханием клеток (Hypo, 200 мосм / л). Пипетка-патч [Ca 2+ ] составляла 100 нМ; внеклеточный Рингер [Ca 2+ ] был 1.3 мМ. (C) Наложение тока на всю ячейку, полученное с 100, 10 или 0 нМ Ca 2+ в растворе для заполнения патч-пипеток. Напряжение на зажимах варьировалось от -100 до +100 мВ с шагом 20 мВ. (D) Резюме гипоиндуцированных плотностей тока целых клеток (Vc = +100 мВ), полученных в ложно-трансфицированных и LRRC8A / C-экспрессирующих клетках HEK293 ( p <0,001 и <0,01, соответственно). Среднее ± SEM; n = 5–9 для каждой серии). # Значительное увеличение по сравнению с макетом (непарные т -тесты).Блоты выполняли в виде повторов.

    TMEM16A поддерживает активацию I

    Cl , набухание в клетках HEK293, сверхэкспрессирующих LRRC8A / C

    Сообщалось, что TMEM16A (и TMEM16F) принимают участие в токе целых клеток, активируемом посредством набухания гипотонических клеток (I Cl , набухание ), хотя не известно, что эти белки напрямую активируются при набухании клеток (Almaca et al. al., 2009; Benedetto et al., 2016; Sirianant et al., 2016a; Liu et al., 2019).Здесь мы исследовали влияние TMEM16A на активацию VRAC при различных внутриклеточных концентрациях Ca 2+ . При концентрации внутриклеточного покоя Ca 2+ , равной 100 нМ, эндогенный VRAC (фиктивный) и сверхэкспрессированный LRRC8A / C легко активируются осмотическим набуханием клеток (200 мосм / л; гипо). Однако активация была нарушена при 10 нМ внутриклеточного Ca 2+ ([Ca 2+ ] i ) (рис. 2A). Даже при низком (10 нМ) [Ca 2+ ] i сверхэкспрессия TMEM16A увеличивала гипотоническую активацию эндогенного VRAC и сверхэкспрессировала LRRC8A / C (Фигуры 2A, B).Это может указывать на то, что приток Ca 2+ также важен для активации VRAC, как предполагалось ранее (Sirianant et al., 2016a).

    Рисунок 2. TMEM16A активируется Hypo и увеличивает I Cl , набухание . (A) Продолжает регистрацию токов целых клеток, активированных в клетках HEK293 за счет гипотонического набухания клеток (Hypo, 200 мосм / л). (B) Соотношение между током и напряжением гипоактивированных токов цельной клетки. TMEM16A активируется Hypo и дополнительно увеличивает I Cl , набухает в клетках, коэкспрессирующих TMEM16A и LRRC8A / C.Среднее ± SEM; n = 8–11 для каждой серии). # Значительное увеличение по сравнению с имитацией ( p <0,05–0,0001; непарные т -тесты).

    Мы намеревались провести аналогичные эксперименты с избыточно экспрессированным TMEM16A при дозировке 100 нМ Ca 2+ , чтобы изучить, как присутствие TMEM16A повлияет на объемную активацию VRAC. Однако мы обнаружили, что сверхэкспрессированный TMEM16A активен даже при этой базовой внутриклеточной концентрации Ca 2+ и без какого-либо дополнительного увеличения Ca 2+ за счет гормональной стимуляции или ионофоров Ca 2+ (Рисунок 3).В этих экспериментах мы использовали буфер CsCl в качестве раствора для заполнения пипеток (100 нМ Ca 2+ ; 290 мосм / л) и внеклеточный буфер CsCl (1,3 мМ Ca 2+ ; 300 мосм / л), чтобы исключить любые возможный вклад токов K + . В отличие от ложно-трансфицированных клеток, клетки, сверхэкспрессирующие TMEM16A, демонстрировали большой базальный входящий ток Cl - , который ингибировался удалением внеклеточного Cl - , вызывая сдвиг вправо обратного потенциала (Фигуры 3A, B).Было обнаружено, что только сверхэкспрессируемый, но не эндогенный TMEM16A, активен на базальных внутриклеточных уровнях [Ca 2+ ], что было подробно исследовано ранее (Sirianant et al., 2016a; Schreiber et al., 2018). Таким образом, было трудно оценить вклад сверхэкспрессированного TMEM16A в активацию набуханием VRAC в клетках HEK293 при [Ca 2+ ] i в 100 нМ.

    Рис. 3. TMEM16A сверхэкспрессируется в клетках HEK293 спонтанно активен. (A) Запись непрерывного тока ложно-трансфицированной и экспрессирующей TMEM16A клетки HEK293. В этих экспериментах раствор для наполнения пипетки и раствор для ванны содержали CsCl (см. Методы). Удаление Cl - из раствора внеклеточной ванны, за исключением 5 мМ (5Cl -), оказало очень небольшое влияние на ложно-трансфицированную клетку, но сильно деполяризовало экспрессирующую TMEM16A клетку. (B) Соответствующие кривые I / V указывают на небольшие токи и слабый эффект 5Cl - в ложно-трансфицированных клетках, тогда как токи были большими и сильно подавлялись при сдвиге реверсивного потенциала в клетках, сверхэкспрессирующих TMEM16A.

    Сверхэкспрессия TMEM16A не была активна в базовых условиях с 10 нМ внутриклеточного Ca 2+ (рис. 2). Сверхэкспрессия TMEM16A вместе с LRRC8A / C дополнительно увеличивала I Cl , набухание , но оставалось неясным, активируется ли сам TMEM16A во время набухания клеток (высвобождением хранилища Ca 2+ или притоком Ca 2+ ) или TMEM16A поддерживает активацию LRRC8A / C. Поэтому мы провели дополнительные эксперименты на клетках HT 29 , которые эндогенно экспрессируют оба ионных канала.

    TMEM16A поддерживает активацию I

    Cl , набухание в HT 2 9 Клетки, экспрессирующие эндогенные LRRC8 и TMEM16A

    Мы повторно исследовали роль TMEM16A в активации LRRC8 / VRAC в клетках HT 29 , которые продуцируют большие эндогенные токи Cl - , активируемые Ca 2+ , и токи VRAC, активируемые набуханием (Centeio et al., 2020; Рисунок 4). Как показано на рисунках 1, 2, эти эксперименты проводились с цитозольным раствором для наполнения пипеток (290 мосм / л, Ca 2+ 100 нМ, pH 7.2; c.f. Методы). Баню перфузировали раствором Рингера (300 мосм / л; Ca 2+ 1,3 мМ, pH 7,4). Нокдаун siRNA эндогенного TMEM16A ослаблял гипоиндуцированные токи целых клеток и изменял не зависящие от времени I Cl , набухание на типичные для VRAC зависящие от времени токи (Рисунки 4A – D). Примечательно, что блокатор TMEM16A, никлозамид (1 мкМ), значительно ингибировал I Cl , набухание с 182 ± 22 до 78 ± 9,2 пА / пФ ( n = 5). Нокаут эндогенного LRRC8A сильно ослаблял I Cl , набухание , в то время как дополнительный нокаут TMEM16A не приводил к дальнейшему ослаблению I Cl , набуханию .Эти данные предполагают, что TMEM16A, экспрессируемый в клетках HT 29 , поддерживает активацию LRRC8 / VRAC, вероятно, облегчая гипоиндуцированное высвобождение Ca 2+ из хранилищ ER Ca 2+ .

    Рисунок 4. TMEM16A поддерживает активацию LRRC8. (A) Hypo (200 мосм / л) -индуцированные наложения тока целых клеток, полученные в клетках HT 29 , обработанных скремблированной РНК (scrbld), siRNA для TMEM16A, LRRC8A или обоих. Концентрация свободного Ca 2+ в растворе для заполнения патч-пипетки составляла 100 нМ. (B) Соответствующие вольт-амперные зависимости. (C) Гипоиндуцированная плотность тока всей клетки (Vc = +100 мВ). (D) Зависящая от времени активация цельноклеточных токов под действием Hypo. Среднее ± SEM; n = 9–14 для каждой серии). # Значительное снижение по сравнению с макетом ( p <0,01 для всех; непарные t -тесты).

    Рисунок 5. Гипотоничность активирует TMEM16A-зависимое повышение Ca 2+ . (A) Сводка плотностей тока, индуцированного гипо (200 мосм / л), ингибируемых DCPIB в клетках HT 29 ( n = 9–15). Концентрация свободного Ca 2+ в растворе для заполнения патч-пипетки составляла 100 нМ. (B) Гипоиндуцированный ток целой клетки перекрывается в клетках HT 29 , обработанных скремблированной РНК (scrbld), siRNA для TMEM16A или обоих TMEM16F. (C) Эффект 2-APB (50 мкМ; p <0,001) и дантролена (50 мкМ; p <0.001) от плотности гипоиндуцированных токов (Vc = +100 мВ) ( n = 9–11). (D) Индуцированный АТФ (100 мкМ) ток целой клетки перекрывается в отсутствие или в присутствии миРНК. (E) Соответствующие вольт-амперные зависимости ( n = 9–11). (F) Влияние 2-APB (50 мкМ; p <0,001) и дантролена (50 мкМ) на плотности тока, индуцированные АТФ (Vc = +100 мВ) ( n = 7–9). (G) Влияние TMEM16A-siRNA на АТФ-индуцированное увеличение Ca 2+ ( n = 21–45; p <0.000004 и p <0,01 соответственно). (H) Эффект TMEM16A-siRNA на гипоиндуцированное повышение Ca 2+ ( n = 21–55; p <0,003). Плато Ca 2+ было определено в конце плато. Среднее ± SEM; # значительное снижение (непарный т -тест).

    Вклад TMEM16A в активацию набухания эндогенного VRAC был исследован на ложно-трансфицированных клетках HEK293 (-T16A) или клетках HEK293, сверхэкспрессирующих TMEM16A (+ T16A) при различной внеклеточной гипотоничности.VRAC активировался раствором внеклеточной ванны с различной гипотоничностью (275, 240, 200 и 150 мосм / л). Данные демонстрируют увеличение гипотонической активации VRAC за счет коэкспрессии TMEM16A, которое было более значительным при менее выраженной гипотонии (дополнительный рисунок S1). Эти эксперименты проводили при 10 нМ внутриклеточной концентрации Ca 2+ .

    Вклад TMEM16A в I

    Cl , разбухание в условиях зажима без напряжения

    Поскольку набухание клеток и регулирование объема происходят в условиях фиксации без напряжения, мы исследовали роль TMEM16A для активации I Cl , набухание в экспериментах по тушению йодида с использованием галогенид-чувствительного желтого флуоресцентного белка (YFP).При применении раствора гипотонической ванны (200 мосм / л) ожидается немедленное увеличение флуоресценции YFP из-за быстрого поглощения воды через аквапорины, разбавления анионов и ослабления флуоресценции YFP, которое происходит в течение нескольких секунд (Benedetto et al. , 2016). За этим следует гашение, вызванное йодидом, поскольку каналы VRAC активируются, что позволяет проникать йодиду (рис. 6В). Анализ максимальной скорости гашения показал четкую активацию галогенидной проводимости гипо (рис. 6С).Нокдаун siRNA TMEM16A или LRRC8A (Фигуры 6A, D) показал результаты, аналогичные результатам экспериментов с патч-зажимом: нокдаун TMEM16A ослаблял гипоиндуцированное тушение, в то время как он не уменьшал дополнительно тушение, ингибируемое siLRRC8A (Фигуры 6E, F). Следует отметить, что в предыдущих исследованиях мы наблюдали обратную корреляцию между экспрессией TMEM16A и LRRC8A. Например, было обнаружено, что TMEM16A сильно активируется в клетках, в которых отсутствует экспрессия LRRC8A (Benedetto et al., 2016). Таким образом, неудивительно, что обнаружение LRRC8A менее эффективно подавляется при параллельном нокдауне TMEM16A (вестерн-блоттинг на фиг. 6A).

    Рис. 6. Гипоиндуцированная анионная проницаемость, измеренная в условиях фиксации без напряжения. (A) нокдаун миРНК LRRC8A, обнаруженный с помощью вестерн-блоттинга. Эффективность нокдауна составила 72%. Нокдаун TMEM16A усиливал экспрессию LRRC8A, что соответствует Benedetto et al. (2016). (B) Резюме временной зависимости гашения YFP, вызванного 20 мМ йодида в присутствии изотонического раствора Рингера (Iso; 300 мосмоль / л) или Hypo (200 мосмоль / л). (C) Краткое изложение начальной скорости закалки (условные единицы / с) ( n = 4; p <0.006). (D) нокдаун миРНК TMEM16A, обнаруженный с помощью вестерн-блоттинга. (E) Краткое изложение временной зависимости гипоиндуцированного тушения YFP в отсутствие или в присутствии миРНК. (F) Сводка начальных скоростей закалки (условные единицы / с) ( n = 19). p <0,0005 (siTMEM16A), p <2 × 10 –11 (siLRRC8A), p <2 × 10 –11 (siLRRC8A / siTMEM16A). (G, H) Гипоиндуцированное тушение YFP ​​отсутствовало в присутствии 0 мМ внеклеточного йодида, но постепенно увеличивалось с 5 мМ ( n = 4; p <0.003), 20 мМ ( n = 4; p <0,0009) и 50 мМ ( n = 4; p <0,0005). Среднее ± SEM; # значительное увеличение или уменьшение соответственно (непарный т -тест). Блоты выполняли в виде повторов.

    Гипотоничность активирует TMEM16A-зависимый Ca

    2+ Повышение

    При анализе мгновенных плотностей пикового тока блокатор VRAC DCPIB ингибировал I Cl , набухание независимо от siRNA-TMEM16A, тогда как siRNA-LRRC8A сильно ингибировал мгновенные пиковые токи (рис. 5A).Однако нокдаун TMEM16A вызывал выраженную зависящую от времени инактивацию I Cl , набухание , и то же самое наблюдалось для нокдауна TMEM16F (Sirianant et al., 2016a; Рисунок 5B). Примечательно, что TMEM16F, как сообщается, также проводит ионы Ca 2+ , помимо его способности скремблировать фосфолипиды (Yang et al., 2012). Таким образом, белки TMEM16 поддерживают активность I Cl , набухают , возможно, за счет поддержки высвобождения ER Ca 2+ и активации притока Ca 2+ (Benedetto et al., 2016; Cabrita et al., 2017). Для дальнейшего выяснения вклада высвобождения хранилища Ca 2+ в активацию I Cl , набухание , клетки набухали в присутствии IP3R-ингибитора 2-ABP или ингибитора RyR дантролена, которые оба ингибировали I Cl , вздутие (рис. 5С). Активация CaCC в клетках HT 29 пуринергическим лигандом АТФ полностью зависела от TMEM16A, как показано siRNA-TMEM16A, и нокдаун LRRC8A не ставил под угрозу активацию CaCC (Фигуры 5D, E).Это указывает на то, что одного повышения Ca 2+ недостаточно для активации VRAC / LRRC8A. В отличие от стимуляции I Cl , набухания , активация CaCC ингибировалась только 2-ABP, но не дантроленом (фиг. 5F). Используя датчик Ca 2+ Fura-2, мы исследовали, как TMEM16A влияет на повышение Ca 2+ , вызванное АТФ и гипо (200 мосм / л). АТФ индуцировал типичный пик (высвобождение запаса ER-Ca 2+ ) и ответ на плато (приток Ca 2+ ; SOCE), которые подавлялись в отсутствие TMEM16A (Cabrita et al., 2017; Рисунок 5G). Гипоиндуцированное увеличение Ca 2+ было намного меньше, но также ингибировалось siRNA-TMEM16A (фиг. 5H). Взятые вместе, данные демонстрируют роль TMEM16A в увеличении Ca 2+ , вызванном набуханием, что важно для полной активации I Cl , набухание .

    В дополнительных экспериментах мы варьировали концентрацию йодида в растворе гипотонической ванны от 0 до 50 мМ (Рисунки 6G, H). Показано, что при 0 мМ йодида тушение не происходит, а происходит только набухание клеток, на что указывает увеличение флуоресценции.С увеличением концентрации йодида во внеклеточном буфере максимум тушения YFP больше не достигается, и скорость тушения YFP увеличивается. Данные указывают на очень быструю активацию VRAC, которая, вероятно, параллельна снижению внутриклеточной ионной силы (Syeda et al., 2016). Напротив, регуляторное уменьшение объема (RVD) занимает значительно больше времени, на что указывает задержка YFP - повторное гашение в присутствии 0 мМ йодида.

    Мы исследовали зависящее от концентрации тушение с помощью АТФ и обнаружили выраженное ингибирование тушения с помощью siRNA-TMEM16A (Фигуры 7A, B).Примечательно, что при выраженной стимуляции насыщающими концентрациями АТФ (50, 100 мкМ) индуцированное АТФ тушение незначительно, но значительно ингибировалось siLRRC8A. Это предполагает вклад VRAC в индуцированную АТФ проницаемость для галогенидов. Мы исследовали эффекты ряда различных ингибиторов на активацию I Cl , набухать , тестируя их индивидуально на клетках HT 2 9 . Мы решили проанализировать эффекты различных ингибиторов в экспериментах по подавлению YFP с недиализованными клетками и в условиях зажима без напряжения (вместо зажима участка целой клетки), чтобы оставить нетронутой внутриклеточную сигнализацию Ca 2+ и избежать артефакты из-за ограничения напряжения.

    Рисунок 7. Роль передачи сигналов Ca 2+ для гипо- и АТФ-индуцированной анионной проницаемости. (A) Зависящее от времени тушение YFP, вызванное различными концентрациями АТФ ( n = 3-5). (B) Зависимость от концентрации АТФ-индуцированного тушения (условные единицы / с) и эффекты нокдауна TMEM16A или LRRC8A ( n = 4). (C) Сводка по АТФ-индуцированному тушению в отсутствие (контроль) или в присутствии блокаторов IP3R ксестоспонгина C (10 мкМ; p <10 –19 ), сурамина (500 мкМ; p <10 –7 ) и пробенецид (1 мМ; p <2 × 10 –9 ) ( n = 4–5). (D) Сводная информация о гашении, индуцированном Hypo (200 мосм / л) в отсутствие (контроль) или в присутствии DCPIB (30 мкМ; p <0,02), Ani9 (10 мкМ), сурамина (500 мкМ; ). p <2 × 10 –7 ), U73122 (10 мкМ; p <0,01), 2-APB (50 мкМ; p <10 –17 ), дантролен (50 мкМ; p <0,02), пробенецид (1 мМ; p <0,03) и NS3728 (10 мкМ; p <0,03) ( n = 4–5). (E, F) Вклад притока Ca 2+ в гипоиндуцированное тушение исследовали путем воздействия на клетки гипотонического раствора в присутствии физиологического (1.3 мМ; n = 5) или низкая (1 мкМ; n = 4; p <0,02) внеклеточная концентрация Ca 2+ . Среднее ± SEM; # - значительное ингибирование (непарный t -тест).

    Три различных ингибитора IP3R-опосредованного высвобождения ER Ca 2+ из хранилища, ксестоспонгин C, сурамин и пробенецид, блокировали АТФ-индуцированную активацию проницаемости для галогенидов (рис. 7C). Гипо (200 мосм / л) -индуцированное тушение блокировалось блокатором VRAC DCPIB, но не блокатором TMEM16A Ani9 (Seo et al., 2016), предполагая, что присутствие TMEM16A, но не его проводимость Cl -, поддерживает активацию I Cl , набухание (рис. 7D). Удивительно, но ингибирующий эффект DCPIB на гипоиндуцированное тушение, т.е. активацию VRAC, был довольно слабым. Однако это, вероятно, объясняется сильной зависимостью от напряжения ингибирования VRAC DCPIB. Во время измерений YFP, DCPIB применялся в условиях фиксации без напряжения, то есть при собственном отрицательном мембранном напряжении ячеек HT 29 , которое составляет около -40 мВ.В дополнительных экспериментах с фиксацией положения мы обнаружили действительно слабое ингибирование VRAC с помощью DCPIB при отрицательных напряжениях фиксации, но гораздо более выраженное ингибирование при деполяризованных напряжениях фиксации (дополнительный рисунок S2). Регулятор трансмембранной проводимости при муковисцидозе (CFTR), другой канал Cl -, экспрессируемый в клетках HT 29 , вряд ли будет вносить вклад в I Cl , набухание , как это сделал ингибитор CFTR CFTRinh272 (30 мкМ). не подавляют активацию VRAC (данные не показаны).

    Ряд соединений, ингибирующих IP3R- и RyR-опосредованное высвобождение ER Ca 2+ -накопителей, таких как сурамин, U73122, пробенецид и дантролен, а также NS3728 (Helix et al., 2003), ингибировали активацию I Класс , набухание . Было обнаружено, что клетки HT 2 9 экспрессируют все три паралога рецептора IP3, а также рецептор рианодина RyR2, а также канал TRPV4, который является каналом притока Ca 2+ , который наиболее часто играет роль. в регулировании объемов (Pasantes-Morales, 2016; дополнительный рисунок S3).Вклад притока Ca 2+ в активацию VRAC был продемонстрирован путем воздействия на клетки гипотонического раствора в присутствии низкого (1 мкМ) внеклеточного Ca 2+ , который ослаблял активацию VRAC (рисунки 7E, F). . Взятые вместе, Ca 2+ не может быть предпосылкой для активации VRAC. Однако высвобождение запаса Ca 2+ и приток Ca 2+ способствуют его активации, что согласуется с более ранними наблюдениями (Akita et al., 2011; Sirianant et al., 2016a; Лю и др., 2019). TMEM16A способствует увеличению внутриклеточного компартментализированного Ca 2+ и, таким образом, поддерживает активацию VRAC. Наряду с активацией набухания VRAC, TMEM16A активируется за счет индуцированного набуханием повышения внутриклеточного Ca 2+ . Степень этой корегуляции I Cl , набухание зависит от клетки и зависит от экспрессии белков TMEM16.

    Обсуждение

    Настоящее исследование исследует активацию I Cl , набухание в двух разных клеточных линиях.Использовали клетки HEK293, потому что эти клетки не экспрессируют TMEM16A и экспрессируют только очень низкие уровни LRRC8A. Таким образом, клеточная линия была идеальной для изучения эффектов сверхэкспрессии TMEM16A и LRRC8A / C. Напротив, клетки HT 29 экспрессируют как TMEM16A, так и LRRC8A и демонстрируют большие АТФ-стимулированные, т.е. Ca 2+ , активированные токи TMEM16A Cl - и выраженные токи LRRC8 / VRAC Cl -, активируемые набуханием. LRRC8A (VRAC) и TMEM16A (CaCC) представляют собой независимые молекулярные образования и каналы Cl - , активируемые набуханием клеток или внутриклеточным Ca 2+ .Хотя белки TMEM16 не являются VRAC per se , предыдущие данные предполагают роль в I Cl , набухании (Almaca et al., 2009; Juul et al., 2014; Benedetto et al., 2016; Sirianant et al. ., 2016a; Liu et al., 2019; Zhang et al., 2020). Анализ I Cl , набухание в тканях мышей, лишенных экспрессии TMEM16A (Almaca et al., 2009), TMEM16F (Ousingsawat et al., 2015; Sirianant et al., 2016a) и TMEM16K (Hammer et al. ., 2015; Wanitchakool et al., 2017) показывает снижение I Cl , набухание ) и снижение нормативного объема (RVD).Вклад TMEM16A и других TMEM16-белков в I Cl , набухание и регуляцию объема зависит от клетки и может быть особенно значимым для высокодифференцированных нативных (не культивируемых) клеток. Не менее важны условия «заплатка-зажим», при которых измеряются I Cl , набухание , что может объяснить некоторые из более ранних противоречивых результатов относительно роли TMEM16F (Almaca et al., 2009; Shimizu et al., 2013; Juul et al., 2014; Sirianant et al., 2016а).

    Эксперименты с патч-зажимом показали более впечатляющие эффекты TMEM16A (и TMEM16F) на активацию VRAC при деполяризованных фиксирующих напряжениях. TMEM16A и TMEM16F в основном отменяют зависящую от времени инактивацию VRAC. Это также было подробно описано в предыдущем исследовании (Sirianant et al., 2016a). Таким образом, влияние TMEM16A менее заметно при отрицательных напряжениях фиксации и в условиях фиксации без напряжения. Тем не менее, даже при отрицательном мембранном напряжении влияние TMEM16A оказалось значительным (рисунок 6 и дополнительный рисунок S4).В то время как ряд транспортных свойств был приписан LRRC8 / VRAC (Planells-Cases et al., 2015; Lutter et al., 2017; Kang et al., 2018; Stuhlmann et al., 2018; Zhou et al., 2020) , его физиологическая значимость с точки зрения регуляции объема все еще остается предметом дискуссий. Мы обнаружили, что клетки способны выполнять RVD также в отсутствие LRRC8A (Milenkovic et al., 2015; Benedetto et al., 2016; Sirianant et al., 2016b), в то время как другие различные члены семейства TMEM16A, CFTR и котранспортер KCl KCC явно способствует регуляции объема (Sirianant et al., 2016b; Wanitchakool et al., 2016). Мы обнаружили, что активация I Cl , набухание происходило быстро (в течение 1 минуты), что, однако, все же несколько задерживалось по сравнению с немедленным набуханием клеток (в пределах секунд) (Benedetto et al., 2016). Это предполагает дополнительные меры регулирования, помимо прямого открытия VRAC с помощью низкой ионной силы (Syeda et al., 2016). Другие и мы предложили Ca 2+ -зависимое развертывание кавеолоподобных мембранных резервов при набухании клеток и активации I Cl , набухания (Groulx et al., 2006; Козера и др., 2009; Бенедетто и др., 2016).

    Этот дополнительный механизм может потребовать увеличения Ca 2+ во внутриклеточном компартменте рядом с плазматической мембраной (Akita et al., 2011; Benedetto et al., 2016; Liu et al., 2019). Лю и др. показали, что внутриклеточный Ca 2+ необходим, но недостаточен для активации LRRC8A-опосредованных токов (Liu et al., 2019). Lemonnier и соавторы представили доказательства совместной локализации VRAC с управляемыми хранилищем каналами Ca 2+ и показали, что активация VRAC сильно зависит от высвобождения Ca 2+ через IP3R (Lemonnier et al., 2002). Они пришли к выводу, что VRAC регулируется внутри микродоменов Ca 2+ . Точно так же Акита и соавторы предположили, что каналы VRAC / VSOR могут быть активированы связанными с ПЛК GPCR, которые зависят от выпуска магазина Ca 2+ в непосредственной близости от канала (Akita and Okada, 2011), и предложили Ca 2+ нанодомен-опосредованный компонент VRAC (Akita et al., 2011).

    Наши настоящие данные могут помочь прояснить роль белков TMEM16 в Ca 2+ -зависимой активации VRAC.Роль TMEM16A и других членов семейства TMEM16 в высвобождении ER Ca 2+ была обнаружена во многих тканях (Jin et al., 2016; Cabrita et al., 2017; Wanitchakool et al., 2017; Benedetto et al., al., 2019a; Centeio et al., 2020; Park et al., 2020). Высвобождение Ca 2+ , контролируемое TMEM16A, также важно для активации CFTR (Benedetto et al., 2017, 2019b; Park et al., 2020). Таким образом, вызванное набуханием клеток высвобождение Ca 2+ из ER и активация VRAC облегчается в присутствии белков TMEM16.Поскольку нокдаун TMEM16A, но не ингибирование TMEM16A с помощью Ani9, ослабляет активацию VRAC, это предполагает, что связывание ER с помощью TMEM16A, а не транспорта Cl - поддерживает активацию VRAC (Jin et al., 2013; Cabrita et al., 2017) .

    Вдоль этой линии TMC8, член близкородственного семейства белков TMC, подобных трансмембранным каналам, также контролирует активацию VRAC и регуляцию объема (Sirianant et al., 2014). В зависимости от типа клеток высвобождение Ca 2+ , вызванное набуханием, активирует белки TMEM16 и CFTR (Thiele et al., 1998; Wanitchakool et al., 2016), что соответствует активации VRAC. Это обстоятельство может объяснить многие более ранние открытия, такие как фармакология перекрывающихся каналов Cl - (Koslowsky et al., 1994; Rottgen et al., 2018; Centeio et al., 2020).

    Заявление о доступности данных

    Необработанные данные, подтверждающие выводы этой статьи, будут предоставлены авторами без излишних оговорок любому квалифицированному исследователю.

    Авторские взносы

    RC, JO и RS провели эксперименты и проанализировали данные.Рукопись написали RC, RS и KK. Все авторы внесли свой вклад в статью и одобрили представленную версию.

    Финансирование

    Эта работа была поддержана Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Немецкий исследовательский фонд) номер проекта 387509280, SFB 1350 (проект A3), DFG KU756 / 14-1 и UK CF Trust SRC013.

    Конфликт интересов

    Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

    Дополнительные материалы

    Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcell.2020.596879/full#supplementary-material

    Список литературы

    Акита Т., Федорович С.В., Окада Ю. (2011). Ca2 + нанодомен-опосредованный компонент индуцированного набуханием объемно-чувствительного внешне выпрямляющего анионного тока, запускаемого аутокринным действием АТФ в астроцитах мыши. Cell Physiol. Biochem. 28, 1181–1190.DOI: 10.1159 / 000335867

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Акита, Т., и Окада, Ю. (2011). Регулирование индуцированной брадикинином активации объемно-чувствительных внешне выпрямляющих анионных каналов с помощью нанодоменов Ca2 + в астроцитах мышей. J Physiol. 589, 3909–3927. DOI: 10.1113 / jphysiol.2011.208173

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Almaca, J., Tian, ​​Y., Aldehni, F., Ousingsawat, J., Kongsuphol, P., Рок, Дж. Р. и др. (2009). Белки TMEM16 производят регулируемые по объему хлоридные токи, которые снижаются у мышей, лишенных TMEM16A. J. Biol. Chem. 284, 28571–28578. DOI: 10.1074 / jbc.m109.010074

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Бенедетто Р., Кабрита И., Шрайбер Р. и Кунцельманн К. (2019a). TMEM16A незаменим для выделения основной слизи в дыхательных путях и кишечнике. FASEB J. 33, 4502–4512. DOI: 10.1096 / fj.201801333rrr

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Бенедетто Р., Ousingsawat, J., Cabrita, I., Pinto, M., Lerias, J., Wanitchakool, P., et al. (2019b). Белки TMEM16, локализованные на плазматической мембране, незаменимы для экспрессии CFTR. J. Mol. Med. 97, 711–722. DOI: 10.1007 / s00109-019-01770-4

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Бенедетто Р., Усингсават Дж., Ванитчакул П., Чжан Ю., Хольцман М. Дж., Амарал М. и др. (2017). Транспорт эпителиального хлорида с помощью CFTR требует TMEM16A. Sci.Отчет 7: 12397. DOI: 10.1038 / s41598-017-10910-0

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Бенедетто Р., Сирианант Л., Панкониен И., Ванитчакул П., Усингсават Дж., Кабрита И. и др. (2016). Связь между TMEM16A / аноктамином 1 и LRRC8A. Pflugers Arch. 468, 1751–1763. DOI: 10.1007 / s00424-016-1862-1

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Кабрита, И., Бенедетто, Р., Фонсека, А., Ванитчакул, П., Сирианант Л., Скрябин Б.В. и др. (2017). Дифференциальные эффекты аноктаминов на внутриклеточные кальциевые сигналы. Faseb J. 31, 2123–2134. DOI: 10.1096 / fj.201600797rr

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Кэннон, К. Л., Басаваппа, С., и Стрэндж, К. (1998). Внутриклеточная ионная сила регулирует объемную чувствительность активированного набуханием анионного канала. Am. J. Physiol. 275, C416 – C422. DOI: 10.1152 / ajpcell.1998.275.2.C416

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Центейо Р., Кабрита И., Бенедетто Р., Талби К., Усингсават Дж., Шрайбер Р. и др. (2020). Фармакологическое ингибирование и активация Ca (2+) активированного Cl (-) канала TMEM16A. Int. J. Mol. Sci. 21: 2557. DOI: 10.3390 / ijms21072557

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Денека, Д., Савица, М., Лам, А. К. М., Паулино, К., и Дутцлер, Р. (2018).Структура регулируемого по объему анионного канала семейства LRRC8. Природа 558, 254–259. DOI: 10.1038 / s41586-018-0134-y

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Гулбинс, Э., Джекле, А., Ферлинц, К., Грассм, Х., и Ланг, Ф. (2000). Физиология апоптоза. Am .. J. Physiol. Почечный. Physiol. 279, F605 – F615. DOI: 10.1152 / ajprenal.2000.279.4.F605

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Хаммер, К., Wanitchakool, P., Sirianant, L., Papiol, S., Monnheimer, M., Faria, D., et al. (2015). Кодирующий вариант ANO10, влияющий на регуляцию объема макрофагов, связан с серопозитивностью Borrelia. Мол. Med. 21, 26–37. DOI: 10.2119 / molmed.2014.00219

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Helix, N., Strobaek, D., Dahl, B.H., and Christophersen, P. (2003). Ингибирование эндогенного анионного канала с регулируемым объемом (VRAC) в клетках HEK293 кислыми диарилмочевинами. J. Membr. Биол. 196, 83–94. DOI: 10.1007 / s00232-003-0627-x

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Исэ, Т., Симидзу, Т., Ли, Э. Л., Иноуэ, Х., Коно, К., и Окада, Ю. (2005). Роль чувствительного к объему Cl-канала в индуцированном цисплатином апоптозе в эпидермоидных раковых клетках человека. J. Membr. Биол. 205, 139–145. DOI: 10.1007 / s00232-005-0779-y

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Джин, X., Шах, С., Ду, X., Чжан, Х., Гампер, Н. (2016). Активация Ca2 + -активированного Cl- канала ANO1 локализованными сигналами Ca2 +. J. Physiol. 594, 19–30. DOI: 10.1113 / jphysiol.2014.275107

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Jin, X., Shah, S., Liu, Y., Zhang, H., Lees, M., Fu, Z., et al. (2013). Активация Cl-канала ANO1 локализованными сигналами кальция в ноцицептивных сенсорных нейронах требует взаимодействия с рецептором IP3. Sci.Сигнал. 6: ra73. DOI: 10.1126 / scisignal.2004184

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Джул, К. А., Грабб, С., Поулсен, К. А., Киед, Т., Хашем, Н., Ламберт, И. Х. и др. (2014). Аноктамин 6 отличается от VRAC и VSOAC, но участвует в апоптозе и поддерживает регуляцию объема в присутствии Ca. Pflugers Arch. 466, 1899–1910. DOI: 10.1007 / s00424-013-1428-4

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Канг, К., Xie, L., Gunasekar, S. K., Mishra, A., Zhang, Y., Pai, S., et al. (2018). SWELL1 - это датчик глюкозы, регулирующий возбудимость бета-клеток и системную гликемию. Nat. Commun. 9: 367. DOI: 10.1038 / s41467-017-02664-0

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Касуя, Г., Накане, Т., Йокояма, Т., Цзя, Ю., Иноуэ, М., Ватанабе, К., и др. (2018). Крио-ЭМ структуры регулируемого по объему анионного канала человека LRRC8. Nat. Struct. Мол. Биол. 25, 797–804.DOI: 10.1038 / s41594-018-0109-6

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Кефовер, Дж. М., Саотоме, К., Дубин, А. Е., Паллесен, Дж., Коттрелл, К. А., Кахалан, С. М. и др. (2018). Структура анионного канала человека, регулируемого по объему. eLife 7: e38461. DOI: 10.7554 / eLife.38461.026

    CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Керн, Д. М., О, С., Хайт, Р. К., и Брохон, С. Г. (2019). Крио-ЭМ структуры DCPIB-ингибированного анионного канала LRRC8A с регулируемым объемом в липидных нанодисках. eLife 8: e42636.

    Google Scholar

    Koslowsky, T., Hug, T., Ecke, D., Klein, P., Greger, R., Gruenert, D. C., et al. (1994). Са2 + и отек вызывают активацию ионной проводимости в эпителиальных клетках бронхов. Pflügers Arch. 428, 597–603. DOI: 10.1007 / bf00374583

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Козера, Л., Уайт, Э., и Калаган, С. (2009). Кавеолы ​​действуют как мембранные резервы, которые ограничивают активацию механочувствительных каналов I (Cl, набухание) во время набухания в миоците желудочков крысы. PLoS One 4: e8312. DOI: 10.1371 / journal.pone.0008312

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Кунцельманн, К., Усингсават, Дж., Бенедетто, Р., Кабрита, И., и Шрайбер, Р. (2019). Вклад аноктаминов в выживаемость и гибель клеток. Раки 19, E382.

    Google Scholar

    Lemonnier, L., Prevarskaya, N., Shuba, Y., Vanden Abeele, F., Nilius, B., Mazurier, J., et al. (2002). Модуляция Ca2 + анионных каналов с регулируемым объемом: свидетельство совместной локализации с каналами, управляемыми хранилищами. FASEB J. 16, 222–224.

    Google Scholar

    Lemonnier, L., Shuba, Y., Crepin, A., Roudbaraki, M., Slomianny, C., Mauroy, B., et al. (2004). Bcl-2-зависимая модуляция активированного набуханием тока Cl- и экспрессии ClC-3 в эпителиальных клетках рака простаты человека. Cancer Res. 64, 4841–4848. DOI: 10.1158 / 0008-5472.can-03-3223

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Лю Т. и Штаубер Т. (2019). Регулируемый по объему анионный канал LRRC8 / VRAC незаменим для пролиферации и миграции клеток. Int. J. Mol. Sci. 20: 2663. DOI: 10.3390 / ijms20112663

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Лю Ю., Чжан Х., Мэн Х., Ду Й., Сяо З., Чжан Ф. и др. (2019). Регулируемый по объему ток Cl (-): вклад отдельных каналов Cl (-) и локализованных сигналов Ca (2+). Am. J. Physiol. Cell Physiol. 317, C466 – C480.

    Google Scholar

    Лу, П., Дин, К., Ли, X., Цзи, X., Ли, Л., Фан, Ю. и др. (2019). SWELL1 способствует росту клеток и метастазированию гепатоцеллюлярной карциномы in vitro и in vivo. EBioMedicine 48, 100–116. DOI: 10.1016 / j.ebiom.2019.09.007

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Люттер, Д., Ульрих, Ф., Люк, Дж. К., Кемпа, С., и Йенч, Т. Дж. (2017). Селективный транспорт нейротрансмиттеров и модуляторов с помощью отдельных регулируемых по объему анионных каналов LRRC8. J. Cell Sci. 130, 1122–1133.

    Google Scholar

    Маккарти, Н. А., О'нейл, Р. Г. (1992). Сигнал кальция в регулировании объема. Physiol. Ред. 72, 1037–1061.

    Google Scholar

    Миленкович А., Брандл К., Миленкович В. М., Джендрике Т., Сирианант Л., Ванитчакул П. и др. (2015). Bestrophin1 представляет собой регулируемый по объему анионный канал в сперматозоидах мышей и пигментном эпителии сетчатки человека. Proc. Natl. Акад. Sci U.SA. 112, E2630 – E2639.

    Google Scholar

    Окада, Ю., Симидзу, Т., Маэно, Э., Танабэ, С., Ван, X. и Такахаши, Н. (2006). Чувствительные к объему хлоридные каналы, участвующие в уменьшении объема апоптоза и гибели клеток. J. Membr. Биол. 209, 21–29. DOI: 10.1007 / s00232-005-0836-6

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Усингсават, Дж., Ванитчакул, П., Кмит, А., Ромао, А. М., Джантараджит, В., Шрайбер, С., и др. (2015). Аноктамин 6 опосредует эффекты, необходимые для врожденного иммунитета ниже рецепторов P2X7 в макрофагах. Nat. Commun. 6: 6245.

    Google Scholar

    Park, J. H., Ousingsawat, J., Cabrita, I., Bettels, R.E., Große-Onnebrink, J., Schmalstieg, C., et al. (2020). Дефицит TMEM16A: потенциально смертельное неонатальное заболевание, возникающее в результате нарушения хлоридного тока. J. Med. Genet. Jmedgenet-2020-106978. [Epub перед печатью].

    Google Scholar

    Педерсен, С. Ф., Окада, Ю., и Нилиус, Б. (2016). Биофизика и физиология анионного канала с регулируемым объемом (VRAC) / объемно-чувствительного наружно выпрямляющего анионного канала (VSOR). Pflugers Arch. 468, 371–383.DOI: 10.1007 / s00424-015-1781-6

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Planells-Cases, R., Lutter, D., Guyader, C., Gerhards, N. M., Ullrich, F., Elger, D. A., et al. (2015). Субъединичный состав каналов VRAC определяет субстратную специфичность и клеточную устойчивость к противораковым препаратам на основе Pt. EMBO J. 34, 2993–3008. DOI: 10.15252 / embj.2015

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Цю, З., Дубин, А.Э., Матур, Дж., Ту, Б., Редди, К., Миралья, Л. Дж. И др. (2014). SWELL1, белок плазматической мембраны, является важным компонентом регулируемого по объему анионного канала. Ячейка 157, 447–458. DOI: 10.1016 / j.cell.2014.03.024

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Роттген, Т. С., Никерсон, А. Дж., И Раджендран, В. М. (2018). Активированный кальцием канал Cl (-): понимание молекулярной идентичности эпителиальных тканей. Int. J. Mol. Sci. 19: 1432. DOI: 10.3390 / ijms132

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Сабиров Р. З., Пренен Дж., Томита Т., Дроогманс Г. и Нилиус Б. (2000). Снижение ионной силы активирует одиночные регулируемые по объему анионные каналы (VRAC) в эндотелиальных клетках. Pflugers Arch. 439, 315–320. DOI: 10.1007 / s004240050945

    CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Schreiber, R., Ousingsawat, J., Wanitchakool, P., Sirianant, L., Бенедетто Р., Рейсс К. и др. (2018). Регулирование ионных токов TMEM16A / ANO1 и TMEM16F / ANO6 и скремблирования фосфолипидов с помощью Ca2 + и липидов плазматической мембраны. J. Physiol. 596, 217–229. DOI: 10.1113 / JP275175

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Со, Й., Ли, Х. К., Пак, Дж., Чон, Д. К., Джо, С., Джо, М., и др. (2016). Ani9, новый мощный низкомолекулярный ингибитор ANO1 с незначительным влиянием на ANO2. PLoS One 11: e0155771.DOI: 10.1371 / journal.pone.0155771

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Симидзу Т., Иехара Т., Сато К., Фуджи Т., Сакаи Х. и Окада Ю. (2013). TMEM16F является компонентом Ca2 + -активированного канала Cl-, но не чувствительного к объему, выпрямляющего наружу канала Cl-. Am. J. Physiol Cell Physiol. 304, C748 – C759.

    Google Scholar

    Sirianant, L., Ousingsawat, J., Tian, ​​Y., Schreiber, R., and Kunzelmann, K. (2014).TMC8 (EVER2) ослабляет внутриклеточную передачу сигналов Zn2 + и Ca2 + и подавляет активацию токов Cl-. Cell Signal. 26, 2826–2833. DOI: 10.1016 / j.cellsig.2014.09.001

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Sirianant, L., Ousingsawat, J., Wanitchakool, P., Schreiber, R., and Kunzelmann, K. (2016a). Регулирование клеточного объема с помощью аноктамина 6: Ca2 +, фосфолипаза A2, осмосенсинг. Pflügers Arch. 468, 335–349. DOI: 10.1007 / s00424-015-1739-8

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Сирианант, Л., Wanitchakool, P., Ousingsawat, J., Benedetto, R., Zormpa, A., Cabrita, I., et al. (2016b). Несущественный вклад LRRC8A в регулирование объема. Pflügers Arch. 468, 1789–1796.

    Google Scholar

    Стрэндж К., Ямада Т. и Дентон Дж. С. (2019). 30-летний путь от регулируемых по объему анионных токов к молекулярной структуре канала LRRC8. J. Gen. Physiol. 151, 100–117. DOI: 10.1085 / jgp.201812138

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Штульманн, Т., Planells-Cases, R., and Jentsch, T. J. (2018). Анионные каналы LRRC8 / VRAC усиливают чувствительность бета-клеток к глюкозе и секрецию инсулина. Nat. Commun. 9; 1974.

    Google Scholar

    Syeda, R., Qiu, Z., Dubin, A. E., Murthy, S. E., Florendo, M. N., Mason, D. E., et al. (2016). Белки LRRC8 образуют регулируемые по объему анионные каналы, которые определяют ионную силу. Ячейка 164, 499–511. DOI: 10.1016 / j.cell.2015.12.031

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Тиле, И.Э., Хуг М. Дж., Хюбнер М. и Грегер Р. (1998). Экспрессия регулятора трансмембранной проводимости при муковисцидозе изменяет ответ на набухание гипотонических клеток и АТФ клеток яичников китайского хомячка. Cell Physiol. Biochem. 8, 61–74. DOI: 10.1159 / 000016271

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Фон Клейст, С., Чани, Э., Буртин, П., Кинг, М., и Фог, Дж. (1975). Иммуногистология антигенного паттерна непрерывной клеточной линии опухоли толстой кишки человека. J. Natl. Cancer Inst. 55, 555–560. DOI: 10.1093 / jnci / 55.3.555

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Voss, F. K., Ullrich, F., Munch, J., Lazarow, K., Lutter, D., Mah, N., et al. (2014). Идентификация гетеромеров LRRC8 как важного компонента регулируемого по объему анионного канала VRAC. Наука 344, 634–638. DOI: 10.1126 / science.1252826

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Ванитчакул, П., Ousingsawat, J., Sirianant, L., Cabrita, I., Faria, D., Schreiber, R., et al. (2017). Клеточные дефекты из-за делеции ANO10 обусловлены нарушением регуляции локальной передачи сигналов кальция. Cell Signal. 30, 41–49. DOI: 10.1016 / j.cellsig.2016.11.006

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Ванитчакул П., Усингсават Дж., Сирианант Л., Маколей Н., Шрайбер Р. и Кунцельманн К. (2016). Cl- каналы в апоптозе. Eur. Биофиз. J. 45, 599–610.DOI: 10.107 / s00249-016-1140-3

    CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Янг, Х., Ким, А., Дэвид, Т., Палмер, Д., Джин, Т., Тиен, Дж. И др. (2012). TMEM16F образует Ca (2 +) - активированный катионный канал, необходимый для скремблирования липидов в тромбоцитах во время свертывания крови. Ячейка 151, 111–122. DOI: 10.1016 / j.cell.2012.07.036

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Чжан Х., Лю Ю., Мэн Х., Чжан Ф. и Чжан Х. (2020). LRRCA8A и ANO1 вносят вклад в индуцированный сывороткой VRAC Ca (2 +) - зависимым образом. J. Pharmacol. Sci. 143, 176–181. DOI: 10.1016 / j.jphs.2020.04.003

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Zhou, C., Chen, X., Planells-Cases, R., Chu, J., Wang, L., Cao, L., et al. (2020). Перенос цГАМФ в клетки-свидетели через анионные каналы с регулируемым объемом LRRC8 усиливает опосредованные укусами интерфероновые ответы и противовирусный иммунитет. Иммунитет 52, 767.e6–781.e6.

    Google Scholar

    Узнайте о доходах из предыдущего / текущего отчета CL / CA

    1. Последнее обновление
    2. Сохранить как PDF
    1. Обзор
    2. Прочие связанные отчеты
      1. Отчет RC Rollforward
      2. Waterfall Report
      3. Unbill RollForward Report
    3. Связанные статьи

    В соответствии с требованиями ASC 606, выручка должна быть раскрыта на основе следующего отчетного периода категорий:

    • Выручка предыдущего периода по счету баланса обязательств по договору

    • Выручка предыдущего периода по балансовому счету Контрактных активов

    • Выручка текущего периода по счету баланса обязательств по договору

    • Выручка текущего периода по балансовому счету Контрактных активов

    • Чистая выручка за текущий период

    • Истинный доход со счета баланса дебиторской задолженности без выставления счетов

    Чтобы соответствовать требованиям к раскрытию информации, Zuora Revenue предоставляет отчет о доходах от предыдущего / текущего отчета CL / CA, чтобы вы могли видеть правильные значения раскрытия информации для контракта на выручку.Поскольку существуют различные интерпретации руководства по раскрытию информации ASC 606, этот отчет разработан с учетом наиболее распространенных требований к раскрытию информации.

    Примечание: Отчет о доходах от предыдущего / текущего CL / CA доступен только на уровне контракта на выручку.

    В документации к этому разделу используются следующие сокращения, а также в заголовках столбцов отчета:

    Аббревиатура

    Описание

    CA

    Контрактный актив

    CL

    Ответственность по договору

    CP

    Текущий период

    CQ

    Текущий квартал

    CY

    Текущий год

    PP

    Предыдущий период

    PQ

    Предыдущий квартал

    г.

    Предыдущий год

    Обзор

    В отчете «Доход от предыдущего / текущего CL / CA» следующие данные взяты из некоторых других отчетов и представлены в этом отчете:

    Точка данных Получено из
    Чистое начальное сальдо за текущий период Общий начальный баланс в отчете RC Rollforward
    Чистый прирост за текущий период Всего добавлений в отчете RC Rollforward
    Чистые выпуски в текущем периоде Общий выпуск в отчете RC Rollforward
    Счета, связанные со строками транзакций права на выставление счета Сумма Неоплаченных счетов из строк проводки права на выставление счета в Отчете по перенаправлению не выставленных счетов
    Неучтенный доход от AR по строкам транзакций права на выставление счета

    Сумма невыплаченной выручки от транзакций с правом выставления счета в отчете Unbill RollForward (также может быть рассчитана на основе чистой выручки в отчете Waterfall и Total Release в отчете RC Rollforward)

    На основе вышеуказанных точек данных можно рассчитать следующие две точки данных и представить их в отчете о доходах от предыдущего / текущего отчета CL / CA:

    • Чистое добавление CA / CL = Общее количество добавлений (отчет RC Rollforward) - Неучтенные счета (сумма из строк транзакции права на выставление счета в отчете Unbill RollForward)

    • Чистый выпуск CA / CL = общий выпуск (отчет RC Rollforward) - Неучтенные счета (сумма из строк транзакции права на выставление счета в отчете Unbill RollForward)

    Затем чистый выпуск CA / CL в текущем периоде будет разделен на PP CA / CL и / или CP CA / CL, которые также представлены в этом отчете следующим образом:

    Тип Заголовок столбца Описание
    Выручка от обязательств по договору предыдущих периодов

    Обязательства по договору предыдущего периода (PP CL)

    Сумма всех доходов от балансового счета предыдущего периода, которая является CL.

    Обязательства по договорам предыдущего квартала (PQ CL)

    Сумма всей выручки со счета баланса предыдущего квартала, которая является CL в текущем периоде.

    Обязательства по контракту предыдущего года (PY CL)

    Сумма всей выручки по балансовому счету прошлых лет, которая является CL в текущем периоде.
    Выручка от активов по контракту предыдущих периодов

    Контрактный актив предыдущего периода (PP CA)

    Сумма всех доходов от балансового счета предыдущего периода, то есть CA.

    Актив по контракту на предыдущий квартал (PQ CA)

    Сумма всей выручки по балансовому счету за предыдущий квартал, которая является СА в текущем периоде.

    Контрактный актив предыдущего года (PY CA)

    Сумма всей выручки по балансовому счету прошлых лет, которая является СА в текущем периоде.
    Выручка по обязательствам по договору текущего периода Обязательства по контракту текущего периода (CP CL) Выручка текущего периода на основе балансового счета CL.
    Обязательства по контракту на текущий квартал (CQ CL) Сумма всех доходов за все периоды текущего квартала с балансового счета, который является CL.

    Обязательства по контракту текущего года (CY CL)

    Сумма всех доходов за все периоды текущего года с балансового счета, который является CL.
    Выручка от актива по контракту текущего периода Контрактный актив на текущий период (CP CA) Выручка текущего периода.
    Актив по контракту на текущий квартал (CQ CA) Сумма выручки за все периоды текущего квартала.

    Контрактный актив на текущий год (CY CA)

    Сумма выручки за все периоды текущего года.

    Общий доход в этом отчете представляет собой сумму PP CL, PP CA, CP CL, CP CA и невыплаченного дохода от AR. Когда вы выполняете сверку отчета, общий доход в предыдущем / текущем отчете CL / CA должен быть равен чистому доходу в водопадном отчете.

    Прочие связанные отчеты

    Чтобы понять, как рассчитывается доход от предыдущего / текущего отчета CL / CA, требуются следующие отчеты, тесно связанные с отчетом «Доход от предыдущего / текущего отчета CL / CA».

    Отчет о повторении транзакций с дистанционным управлением

    Этот отчет может отображать начальное и конечное сальдо CA / CL и операции за текущий период. Общие добавления, общий выпуск и конечный баланс важны для получения чистых добавлений CA / CL и чистого выпуска CA / CL для дохода из предыдущего / текущего отчета CL / CA.

    Отчет о водопаде

    В этом отчете может отображаться график амортизации чистой выручки, которая представляет собой сумму выручки по договору и выручки от корректировок. Чистый доход в отчете Waterfall и общий выпуск в отчете RC Rollforward используются для расчета незарегистрированного AR для дохода из предыдущего / текущего отчета CL / CA.

    Отчет о выставлении счетов за пересылку

    При вычислении общего количества добавлений и общего выпуска из отчета RC Rollforward также включаются строки транзакции с флагом «Право на выставление счета», установленным на Y.Согласно ASC 606, для получения истинных чистых добавлений CA / CL и чистого выпуска CA / CL для текущего периода, выручка от строк транзакций с правом выставления счета должна быть исключена. Столбец Незавершенные счета в Отчете по авансированию не выставленных счетов указывает счета, которые связаны со строками транзакции права на выставление счета.

    Статьи по теме

    • Для получения подробных объяснений ключевых точек данных, задействованных в этом отчете, см. Ключевые точки данных.

    • Чтобы понять внутреннюю логику вычислений этого отчета, см. Логика вычислений.

    • Образец контракта на выручку показывает, как создается отчет. Для получения дополнительной информации см. Пример контракта на выручку.

    Cruiser Photo Index CL / CA-30 USS HOUSTON - Navsource

    . Гидросамолеты
    Нажмите на изображение
    , чтобы увидеть его в полном размере
    Размер Изображение Описание Предоставлено
    Автором и / или Авторским правом

    0403041
    1.2 мес. Хьюстон , готовясь спуститься по дорогам 7 сентября 1929 года в Ньюпорт-Ньюсе. Уильям Бакстер

    0403043
    2 мес. USS Houston (CL 30) запускается в Newport News Shipbuilding and Dry Dock Company, Ньюпорт-Ньюс, Вирджиния, 7 сентября 1929 года. Майкл Мохл

    0403044
    1.4 мес. USS Houston (CL 30) правый борт Корма, показанная после спуска на воду на судостроительной фабрике Ньюпорт-Ньюс. Док компании, Ньюпорт-Ньюс, Вирджиния, 1 октября 1929 года. Майкл Мохл

    0403045
    842k USS Houston (CL 30) нос правого борта после спуска на воду в судостроительной и док-компании Ньюпорт-Ньюс, Ньюпорт-Ньюс, Вирджиния, 11 октября 1929 года. Майкл Мохл

    0403035
    485к Хотя изображение немного тусклое, изображение поднятие флага на HOUSTON на ее церемонии ввода в эксплуатацию (@Norfolk, VA) 17 июня 1930 года - единственное, что я когда-либо видел. На обратной стороне написано зелеными чернилами, например, в официальном журнале. написано: «Когда Старая Слава впервые пролетела над ХЬЮСТОНОМ».Дон Кен, Младшая коллекция Дон Кен младший
    92к

    USS Houston (CL 30) Вероятно, сфотографирован в 1930 году на время ее завершения.

    Фотография исторического центра ВМС США - NH 53586.

    USNHC
    120 КБ Недатированное довоенное изображение. США
    11к Недатированное довоенное изображение, (очень маленькое) США
    17к довоенный, здесь стоит на якоре у пирса. США

    0403023
    111к

    Фотография без даты Houston на якоре, приспособленная для платья Судно.

    Фото Джорджа Уинстеда

    Роберт М. Сиери

    0403024
    286к

    Вид носовой части порта на ходу, дата и место неизвестны.

    Фотография ВМС США.

    Рон Титус

    0403039
    100 тыс. USS Houston (CA 30) довоенная открытка.Из Коллекция Отто Шварца. Дон Кен младший

    0403030
    928k USS Houston (CA 30) причал в Перл-Харборе Довоенный. Дэррил Бейкер

    0403037
    288k USS Houston в Хьюстонском судоходном канале, 20 Октябрь 1930 г., во время первого визита в одноименный город.Из Коллекция Отто Шварца. Дон Кен младший

    0403040
    362к Вид сверху на Houston в море, ок. рано 1930-е гг. Из коллекции Отто Шварца Дон Кен младший

    0403031
    760к USS Houston (CA 30) показан в Шанхае около 1931 г. Дэррил Бейкер

    017
    101к

    USS Джейсон уходит слева как Vought O2U-3 или поплавок O2U-4 Corsair из состава Scouting Squadron Eleven катапультирован из USS Houston (CA 30) , на Дальнем Востоке вод, около 1931-1932 гг.

    Фотография ВМС США № NH 94188 из коллекции ВМС США. Управление истории и наследия, коллекция лейтенанта Оскара В.Леви, USN (Корпус снабжения), (в отставке).

    Роберт Херст
    61к

    USS Houston (CA 30) Сфотографировано во время раннего или середина 1930-х гг.

    Фотография исторического центра ВМС США - NH 53588.

    USNHC
    144к

    USS Houston (CA 30) Правый борт корабля 5 дюймов / 25 орудий в боевые действия, во время отработки зенитных боевых действий у побережья Чефу, Китай, 1932-33 гг.

    Фотография исторического центра ВМС США - NH 53590.

    USNHC
    65 КБ

    USS Houston (CA 30) В Циндао, Китай, 4 июля 1933 г. «одетый комбинезон» к празднику. Она летит на четырехзвездочном флаг адмирала Монтгомери М. Тейлора, главнокомандующего азиатского происхождения Флит, на ее форпике.С любезного разрешения главного радиолога В.Р. Лукаса, USN (окончание карьеры), 1973 г.,

    Фотография исторического центра ВМС США - NH 78368.

    USNHC

    0403047
    440 тыс. Вид носовой части порта во время швартовки, возможно, в Лонг-Бич, ок. начало 1934 года. Из коллекции Отто Шварца. Дон Кен младший
    94к

    11 июля 1934 года на борту находился президент Франклин Делано Рузвельт. U.S. cruiser Houston , когда он пересек Панаму Канал на пути из Аннаполиса, штат Мэриленд, в Портленд, Орегон. Это был первый проход через канал президент Соединенных Штатов во время своего пребывания в должности. Военный почести были оказаны на Мирафлоресе, поскольку военный корабль остановился перед блокировка в Тихом океане. Houston имел посадил Рузвельта и его группу в Аннаполисе 1 июля, переход к каналу через мыс Аитьен, Маягуэс, Сан-Хуан, Санкт-ПетербургТомас, Санта-Крус и Картахена. После дневного тура в Бальбоа 12-го числа президент снова сел на самолеты Houston, и крейсер отправился в 17:30. в Портленд через Кокосовые острова Остров и Гонолулу. Находясь у власти, президент Рузвельт должен был совершить еще четыре визита в Панаму, два на борту Houston в 1935 и 1938 годах и два на крейсере Tuscaloosa в 1940 г. Houston , выпущенный Newport News Shipbuilding & Dry Dock Co. в 1929 году совершила свой последний переход канала в 1939 году. Через год судно было отправлено на Филиппины как флагман азиатского флота. После нескольких боевых действий против японцев во время в первые несколько недель Второй мировой войны Houston был потерян в Битва на Яванском море в конце февраля 1942 года.Имея сражений с намного превосходящими силами тяжелый крейсер стал один из самых почетных кораблей войны, выигравший два сражения звезды и Цитата Президента.

    Фотография и комментарий из книги «Корабли Панамского канала», автор: Джеймс Л. Шоу

    Майкл Мохл

    0403049
    1,1 м

    USS Houston (CA 30) пересекает Панамский канал с Президентская партия Франклина Делано Рузвельта 11 июля 1934 г. по пути из Аннаполиса, штат Мэриленд, в Портленд, штат Орегон.Это было первый проход через канал президентом США Состояния при исполнении служебных обязанностей.

    Фотография ВМС США. Это изображение было выпущено в США. ВМС с ID 140609-N-ZZ999-004

    Роберт Херст

    0403021
    177k

    Off Cocoanut Island, Hilo, T.H., 25 июля 1934 года.

    Фото Тай Синг Лоо.

    Роберт М. Сиери
    40к USS Houston входит в Перл-Харбор с Президент Рузвельт на борту. Вероятно, в 1934 году. Стив Кардали

    0403054
    3,5 м
    USS Houston 20 августа 1934 г., прибытие в Гавань Гонолулу, T.Х. с президентом Ф.Д. Рузвельт на борту.

    Национальный архив, фото № 23939159

    Дэвид Аптон

    0403022
    151к

    Обращение в Перл-Харбор, 1934 год.

    Фото Тай Синг Лоо.

    Роберт М. Сиери
    47к Президент Рузвельт разговаривает с военно-морскими кадетами в Перл Харбор.Вероятно, в 1934 году. Стив Кардали
    38к USS Houston маневрирует в Перл-Харборе. Вероятно, в 1934 году. Стив Кардали
    59к Президент Рузвельт, агенты секретной службы и Капитан USS Houston . Вероятно, в 1934 году. Стив Кардали
    50к Президент Рузвельт и компания рядом с USS Housto n в Перл-Харборе, Гавайи.Вероятно, в 1934 году. Стив Кардали
    119k

    USS Houston (CA 30) Стоит на якоре у Сан-Педро, Калифорния, 18 апреля 1935 года. Справа - тяжелый крейсер типа "Новый Орлеан". задний план.

    Фотография из собраний Министерства военно-морского флота США. Национальный архив - 80-CF-21337-1.

    Национальный архив
    120 КБ

    U SS Houston (CA 30) от Сан-Диего, Калифорния, в Октябрь 1935 года, с президентом Франклином Д.Рузвельт на борту. Она развевает четырехзвездочный флаг адмирала на фок-мачте, и Президентский флаг на пике ее грот-мачты.

    Фотография исторического центра ВМС США.

    США

    0403046
    169k

    U SS Houston (CA 30) от Сан-Диего, Калифорния, в Октябрь 1935 года, с президентом Франклином Д.Рузвельт на борту. Она развевает четырехзвездочный флаг адмирала на фок-мачте, и Президентский флаг на пике ее грот-мачты.

    Фотография исторического центра ВМС США.

    Джон Спайви

    0403053
    66к Президент Франклин Д. Рузвельт на USS Хьюстон у острова Кокос, октябрь 1935 г. отдыхает на Карибах. Майкл Мохл
    198k Вид носовой части порта во время плавания в Уилламетте Река, Портленд, Орегон, август 1936 года. Уолтер Нэсмит LST-19
    652к

    The USS San Francisco (CA 38) является форвардом USS Tuscaloosa (CA 37) слева и USS Houston (CA 30) является форвардом USS Chicago (CA 29) на верфи Mare Island Navy Yard между 3-м и 5-м ноября 1936 г.

    Фотография ВМС США.

    Дэррил Бейкер

    0403028
    949k USS Houston (CA 30) на острове Мэр на 10 Сентябрь 1937. Дэррил Бейкер

    0403029
    910k USS Houston (CA 30) около 1938 г. неизвестный. Дэррил Бейкер

    0403032
    317к Подпись к фотографии: «(Ny-14) В МОРЕ С ФЛОТОМ ----- ПОСЛЕ HOUSTON "ПОШЕЛ" --- Это фото U.S.S. Houston , крейсер, доставивший президента Рузвельта на Карибские военные игры, выпущенные сегодня военно-морским ведомством. Позже адмирал Уильям Д. Лихи сообщил, что Houston теоретически был потоплен подводной лодкой "противника" ранее в игре. в окрестностях Виргинских островов.Это фото сделано из Авианосец Lexington . (c31720) APWIREPHOTO SEE STORY " Джонатан Ино

    0403033
    334к Подпись к фотографии: "CTN-I- Charleston S.C. March 3 --- ПРЕЗИДЕНТ РУЗВЕЛЬТ ПРИБЫЛ В ЧАРЛСТОН ------ Морские офицеры приветствовать их вождя, когда он сегодня прибывает на борт крейсера Хьюстон после просмотра военно-морских игр в Карибском море.« Джонатан Ино
    310к 1939 год, в Панамском канале в сторону Тихого океана. Брюс Констебль

    0403036
    87к Пришвартовался на Гавайях во время пребывания в так называемом «Гавайский отряд» (1939). Коллекция Дона Кена-младшего через Отто Schwarz Дон Кен младший

    0403051
    138k Отправление с якорной стоянки на Лахайн Роудс для ее финала переоборудование в США в 1940 году. Она получила свой модернизированный MK19. директора и дополнительные 5-дюймовые пистолеты, но без ванн на 3 дюйма / 50 кал или 1,1 дюйма монтирует. Из коллекции Отто Шварца. Дон Кен младший

    0402950
    104к

    USS Houston (CA 30) впереди USS Чикаго (Калифорния, 29), , 10 сентября 1940 года на острове Мэр. Военно-морская верфь. USS Ramapo (AO 12) стоит у причала USS Хьюстон и USS Уильям Уорд Берроуз (AP 6) и YD 33 (150-тонный кран) находятся рядом с USS Chicago .

    НАРА Сан-Франциско, Судостроительная верфь ВМС Мэр-Айленд

    Трейси Уайт

    0403025
    93к

    Вид на мачту в кают-компании.

    Национальный архив, Сиэтлское отделение, Record Group 181.

    Трейси Уайт
    906к

    USS Houston (CA 30) впереди USS Чикаго (Калифорния, 29), , 10 сентября 1940 года на острове Мэр. Военно-морская верфь. USS Ramapo (AO 12) стоит у причала USS Хьюстон и USS Уильям Уорд Берроуз (AP 6) и YD 33 (150-тонный кран) находятся рядом с USS Chicago .На этом снимке хорошо видны зенитные орудия, добавленные к Кормовая рубка Чикаго.

    Фотография ВМС США.

    Дэррил Бейкер

    0403050
    480 КБ USS Houston разгрузка USS Августа (на заднем плане) как Азиатский флот флагман, ноябрь 1940 г.Из коллекции Отто Шварца. Дон Кен

    0403038
    529k Отряд для экипажа USS Houston (CA 30) , 23 Ноябрь 1940 года, Филиппины. От Отто Шварца Коллекция. Дон Кен младший
    92к

    USS Houston (CA 30) в Манильском заливе, Филиппинские острова, в 1940-41 гг., после последних доработок.Предоставлено Робертом И. Мартин, 1975.

    Фотография исторического центра ВМС США - NH 81592.

    USNHC

    0403052
    151к Curtiss SOC-3 "Чайка" сидят на катапульты. Группа кораблей на вешалке. Январь 1942 г., а работает из Дарвина, Австралия. Дэвид Аптон

    0403042
    353k

    " USS HOUSTON (CA 30) в Tjilatjap, Java, февраль 1942 г., как видно из USS MARBLEHEAD (CL 12 ).Урон HOUSTON 's кормовая рубка может показаться не слишком драматичной, но почти шесть десятков человек были убиты и ранены. Бронированная крышка ее башни дальномер был снесен взрывом вместе с внешним двери. Очертания разрушенных спасательных плотов видны на краска на башне. Перфорировано более 200 мелких фрагментов стороне самой рубки, что привело к пожарам, распотрошил интерьер и убил большую часть артиллерийского расчета башни.Башня уже была натренирована на 30 градусов, когда бомба ударил, и повреждения временно заморозили его в этом положении ».

    Фотография NARA II из Marblehead's Action Reports

    Роберт С. Стерн и Дон Кен младший
    61к

    USS Houston (CA 30) (справа в центре) в Дарвине, Австралия, вероятно, 15 или 18 февраля 1942 г.Эсминец за кормой Хьюстон - это USS Пири (DD 226) . Среди кораблей на заднем плане, Слева - HMAS Terka и SS Зеландия . Донор находился на борту HMAS Tolga , затем использовался как вода. перевозчик для кораблей в гавани Дарвина. Предоставлено Артуром В. Томас.

    Фотография исторического центра ВМС США - NH 43649.

    USNHC / Брюс Констебль

    0403048
    72к

    Глядя с австралийского корвета, HMAS Warrnambool (J 202) , в сторону USS Houston (CA 30) (справа), с USS Пири (DD 226) вдоль стороны в начале февраля 1942 года.

    Австралийский военный мемориал, Фото № P05303.011

    Майк Грин

    0403034
    297k Японская агитационная открытка о потоплении USS Хьюстон (Калифорния, 30) в марте 1942 года. Арнольд Патнэм

    Роль белков CLCA в воспалительном заболевании дыхательных путей

    В этом разделе мы рассмотрим модели клеток и животных, которые были изучены для определения роли белков CLCA в развитии воспалительных заболеваний дыхательных путей.Однако еще до того, как была начата работа по изучению функции CLCA в легких, в нескольких сообщениях предполагалось, что белки CLCA могут играть роль супрессоров опухолей. Например, исследования меланомы на мышах показали, что характер метастазирования коррелирует с участками экспрессии Clca, и что антитела против Clca блокируют метастазирование в легкое (19, 45). Кроме того, у мышей, иммунизированных очищенным bClca2, развивалась устойчивость к метастазам (46). Другие исследования показали, что в клетках рака груди человека отсутствует обычная экспрессия экспрессии hCLCA2, а сверхэкспрессия hCLCA2 снижает способность этих клеток к инвазии и образованию опухолей у голых мышей (47).Точно так же клетки рака молочной железы мыши экспрессировали уменьшенное количество mClca1, mClca2 и mClca5, а повторная экспрессия или сверхэкспрессия этих белков снижала рост клеток и повышала чувствительность к апоптозу (36, 48). Связанная работа показала, что взаимодействие между hCLCA2 на эндотелиальных клетках и его лигандом бета-4 интегрина на клетках рака молочной железы может опосредовать более агрессивное поведение опухоли (41, 43, 49). Точно так же члены семейства CLCA с функциональными доменами связывания интегрина бета-4 могут использовать этот механизм для активации передачи сигналов киназы фокальной адгезии к киназе, регулируемой внеклеточными сигналами (ERK), с потенциалом регулирования выживаемости клеток (42, 43).Снижение экспрессии hCLCA2 также наблюдается в образцах рака груди, и это снижение, по-видимому, связано с метилированием ДНК (50). Недавняя работа также показывает, что ген hCLCA2 может быть удален в образцах лимфомы из клеток мантии (51). Эти исследования подчеркивают возможную роль hCLCA2 как супрессора опухолей и закладывают основу для исследований hCLCA1 при воспалительных заболеваниях дыхательных путей. Связь между активностью белков CLCA как супрессоров опухолей и иммуномодификаторов не изучена.

    Модели изолированных клеток

    Исследования изолированных клеток, возможно, были первыми, в которых была выявлена ​​роль белков CLCA в иммунитете.В частности, сверхэкспрессия mClca3 или hCLCA1 в линии мукоэпидермоидных клеток человека NCI-h392 вызывает значительное увеличение продукции муцина (52, 53). Эти данные свидетельствуют о том, что белки CLCA могут регулировать уровень выработки слизи и, как следствие, эффективность мукоцилиарного клиренса частиц и микробных патогенов. Используя эту клеточную модель, исследователи изучили возможность того, что белки CLCA работают как ионные каналы, чтобы каким-то образом влиять на выработку слизи. Например, исследователи использовали нифлуминовую кислоту (препарат, который якобы является специфическим ингибитором активности хлоридных каналов), чтобы блокировать увеличение продукции муцина, обнаруженное в клетках NCI-h392, которые экспрессируют hCLCA1 (53).В связанной работе другая группа показала, что нифлумовая кислота подавляет АТФ-опосредованный экзоцитоз муцина в клетках HT29-Cl.16E (54). Точно так же Макнамара и его коллеги обнаружили, что индукция аденозином биосинтеза муцина зависит от трансактивации рецептора EGF, и что нифлумовая кислота ингибирует этот тип трансактивации (55). Другая работа с производным нифлумовой кислоты MSI-2216 также продемонстрировала ингибирование образования слизи (56, 57). Эти исследования сделали вывод о роли белков CLCA в сигнальном пути, ведущем к синтезу и секреции муцина, но не предоставили прямых доказательств того, как белки CLCA могут участвовать в этом процессе.Поскольку структурный анализ теперь показывает, что белки CLCA сами по себе не могут быть мембранными ионными каналами, существует потребность в более подробном изучении того, как белки CLCA могут контролировать развитие слизистых клеток.

    Хотя был достигнут некоторый прогресс в установлении роли hCLCA1 в метаплазии слизистых клеток на изолированных клеточных моделях, имеется мало информации о функции CLCA в культурах гладких мышц дыхательных путей. Возможно, что белки CLCA могут влиять на поведение гладкой мускулатуры дыхательных путей, поскольку антисмысловые олигонуклеотиды, которые подавляют экспрессию mClca, по-видимому, ингибируют гиперреактивность дыхательных путей у мышей, зараженных овальбумином (52).Имеющиеся отчеты показывают, что hCLCA1 (и гомологичный mClca3) локализованы в гранулах муцина слизистых клеток в легких, желудочно-кишечном тракте и матке и не экспрессируются в гладких мышцах дыхательных путей (28, 34, 58, 59). Однако mClca4 экспрессируется на значительном уровне в гладких мышцах дыхательных путей мышей (35). Кроме того, поток хлоридов, активируемый кальцием, обнаруживается в гладких мышцах сосудистой сети, уретры и лимфатических сосудах (60–62). Поскольку по крайней мере некоторые белки CLCA / Clca могут деполяризовать клеточные мембраны (15), возможно, что экспрессия CLCA в гладких мышцах дыхательных путей может привести к сужению бронхов.Как и в случае со слизистыми клетками, функция CLCA в гладкомышечных клетках все еще требует определения.

    Модели на животных

    Возможно, лучшее доказательство биологической роли белков Clca было получено на животных моделях воспалительного заболевания дыхательных путей. В этом случае серия исследований установила связь между экспрессией белков Clca в легких и развитием воспалительного заболевания дыхательных путей. Одно из первых сообщений было получено при исследовании модели аллергической астмы на мышах, которая зависит от сенсибилизации и последующей ингаляционной провокации овальбумином.Используя эту модель, сообщалось, что mClca3, по-видимому, регулирует метаплазию слизистых клеток и гиперреактивность дыхательных путей (52). В этих условиях развитие метаплазии слизистых клеток и гиперреактивности дыхательных путей ингибировалось введением полноразмерного антисмыслового олигонуклеотида mClca3 , доставляемого с аденовирусной векторной системой. Эти исследователи не осознавали, что эта полноразмерная конструкция может также взаимодействовать с общими гомологиями последовательностей у других членов семейства mClca.Тем не менее, экспрессия mClca3 в эпителии дыхательных путей была достаточной, чтобы вызвать метаплазию слизистых клеток и гиперреактивность дыхательных путей у этих животных. Это открытие согласуется с доказательствами того, что экспрессии mClca3 было достаточно, чтобы управлять продукцией муцина в клетках NCI-h392 (52, 53).

    В дополнение к этим исследованиям аллергической астмы на мышах, другая группа изучала роль белков Clca в развитии аллергического астматического заболевания у лошадей. У этого вида развивается заболевание эпизодической рецидивирующей обструкции дыхательных путей (также известное как вздутие), которое также проявляется метаплазией слизистых клеток и гиперреактивностью дыхательных путей (63–65).Патогенез этого заболевания лошадей также включает продукцию цитокинов Th3 (особенно IL-4 и IL-13) (66). Кроме того, как и заболевание дыхательных путей, которое развивается у мышей и людей, Muc5ac является преобладающим муцином дыхательных путей, который экспрессируется во время развития метаплазии слизистых клеток (67). Таким образом, заболевание лошадей проявляет характерные черты астмы и ХОБЛ у человека, а также модели хронического заболевания дыхательных путей, вызванные аллергеном и вирусной инфекцией у мышей (68). Следовательно, казалось вероятным, что лошадиные белки Clca также будут вовлечены в патобиологию метаплазии слизистых клеток астматического заболевания, развивающегося у лошадей.Действительно, исследователи сообщают о значительном увеличении экспрессии eClca1 в эпителии дыхательных путей лошадей с рецидивирующей обструкцией дыхательных путей у лошадей (25, 69).

    В рамках особого подхода к пониманию основ воспалительного заболевания дыхательных путей наша лаборатория также пришла к оценке роли генного семейства Clca (24). Наша группа стремилась генетически отделить метаплазию слизистых клеток от гиперреактивности дыхательных путей на мышиной модели и, таким образом, идентифицировать молекулярный путь, который может быть связан с одним признаком заболевания.Другие также использовали инбредные линии мышей для определения генетического влияния на заболевание дыхательных путей, но эта работа в основном сосредоточена на развитии гиперреактивности дыхательных путей (70–78). В обычном случае эти предыдущие исследования были направлены на определение генетического локуса для одного количественного признака, а не на отделение одного признака от другого в сложном фенотипе. Более того, обычная модель заражения аллергеном при заболевании дыхательных путей не часто учитывала хроническую природу фенотипа. Принимая во внимание хорошо описанную роль респираторно-синцитиального вируса (RSV), а также других вирусов в хроническом заболевании дыхательных путей (79–84), мы разработали мышиную модель вирусного бронхиолита.Инфекционным агентом, используемым в этой модели, является вирус Сендай (SeV), вирус парагриппа мышей, похожий на другие парамиксовирусы, которые чаще инфицируют людей. Однако мыши относительно устойчивы к заражению патогенами человека, такими как RSV. Напротив, SeV реплицируется с высокой эффективностью в легких мыши, а инфекция SeV вызывает повреждение и воспаление мелких дыхательных путей (то есть бронхиолит), что неотличимо от аналогичного состояния у людей. За этой острой реакцией следует отсроченное, но необратимое переключение на хроническое заболевание дыхательных путей, которое характеризуется образованием слизи (метаплазия слизистых клеток) и повышенной реактивностью дыхательных путей на вдыхаемый метахолин (гиперреактивность дыхательных путей) (24, 85, 86).Мы пришли к выводу, что оба эти признака индуцируются на долгосрочной основе после вирусного бронхиолита у инбредных мышей линии C57BL / 6J (86). Напротив, мы обнаружили, что штамм Balb / cJ реагировал аналогичным образом во время острой инфекции, но не смог развить никаких хронических заболеваний дыхательных путей (24).

    Мы воспользовались этим различием в генетической предрасположенности для создания популяции кросс-кросса F2 с фенотипическими крайностями, которые проявляют тот или иной признак заболевания, и проанализировали эти крайние значения для экспрессии генов с использованием олигонуклеотидных микрочипов (24).Эта комбинированная генетическая и геномная стратегия предоставила доказательства избирательной связи между экспрессией члена семейства генов mClca , т.е. mClca3 , с развитием метаплазии слизистых клеток, но не гиперреактивностью дыхательных путей. В подтверждение взаимосвязи между экспрессией mClca3 и метаплазией слизистых клеток мы также обнаружили, что перенос гена mClca3 в дыхательные пути мыши (с использованием аденоассоциированного вирусного вектора) был достаточен для образования метаплазии слизистых клеток, но не вызвал прохождения в дыхательных путях гиперреактивность (24).Затем мы создали мышь, гомозиготную по целевой нулевой мутации гена mClca3 ( mClca3 - / - ). Однако у мышей mClca3, - / - развилась такая же степень метаплазии слизистых клеток (и гиперреактивности дыхательных путей), что и у мышей дикого типа, как на вирусных моделях хронического заболевания дыхательных путей, так и на моделях с аллергеном (24).

    Так как экспрессия гена mClca3 была достаточной, но не необходимой для развития метаплазии слизистых клеток, мы пришли к выводу, что другой механизм также должен быть способен опосредовать хроническое изменение поведения дыхательных путей.Мы специально задались вопросом, может ли другой ген mClca быть ответственным за такой эффект. Соответственно, мы использовали программу BLAST (87) для поиска гомологов гена mClca3 и, следовательно, обнаружили четыре дополнительных гена mClca , фланкирующих mClca3 на хромосоме 3 мыши. Мы предварительно назвали эти гены mClca5 , mClca6 , mClca7 и mClca8 ; и впоследствии эти гены получили те же обозначения (23, 88) с гомологией с членами семейства CLCA человека, как показано на.Поскольку другие члены семейства mClca также экспрессируются в ткани дыхательных путей (88, 89), они могут компенсировать потерю mClca3 и тем самым способствовать развитию метаплазии слизистых клеток в условиях дефицита mClca3 (24). Действительно, мы недавно показали, что члены семейства mClca могут проявлять функциональную избыточность в развитии воспалительного заболевания дыхательных путей. В частности, экспрессия mClca5 также увеличивалась вместе с метаплазией слизистых клеток и гиперреактивностью дыхательных путей после вирусной инфекции (24).Кроме того, переноса гена mClca5 в эпителий дыхательных путей было достаточно, чтобы вызвать метаплазию слизистых клеток, но не гиперреактивность дыхательных путей (24). Предварительные исследования показывают, что экспрессия mClca6 в эпителии дыхательных путей также достаточна для метаплазии слизистых клеток, но не гиперреактивности дыхательных путей (90).

    Другая группа также признала, что дефицит mClca3 сам по себе не влияет на развитие метаплазии слизистых клеток после заражения аллергеном, но их анализ генетической компенсации был ограничен уровнями экспрессии mClca1, mClca2 и mClca4 (91).Фактически, наша работа показывает, что mClca5, mClca6 и mClca7 являются более подходящими кандидатами на компенсаторную функцию. Учитывая обширную гомологию последовательностей членов семейства mClca, вероятно, что mClca3, антисмысловые олигонуклеотиды могут связываться и ингибировать несколько членов семейства. В этих условиях нокдаун гена mClca может ингибировать индукцию метаплазии слизистых клеток и гиперреактивности дыхательных путей после вирусной инфекции, но эта возможность все еще требует формального тестирования.

    Точные сигналы, которые регулируют экспрессию гена mClca на мышиных моделях воспалительного заболевания дыхательных путей, также изучаются. Большинство исследований показывают, что цитокины Th3 (IL-4, IL-9 и IL-13) вызывают повышенную экспрессию белков CLCA в культуре клеток (53, 92–94). Однако по крайней мере одна группа не обнаруживает этой взаимосвязи (94, 95), предполагая, что состояние культивируемых клеток может влиять на реакцию на цитокин. Например, степень дифференцировки клеток может влиять на экспрессию рецептора цитокина или сигнальную функцию рецептора.Действительно, экспрессия рецептора IL-13 и его сигнальная функция могут быть критическими детерминантами метаплазии слизистых клеток после вирусной инфекции (96). В этом отношении фактор транскрипции Stat6, который передает сигнал от рецепторов IL-4 и IL-13, также необходим для усиления экспрессии гена CLCA (93). Точно так же повышенная экспрессия Clca развивается вместе с повышенной экспрессией IL-13 в мышиных моделях заболеваний дыхательных путей, вызванных вирусами и аллергенами (24, 52, 91, 96, 97). Более того, повышенная экспрессия Clca развивается после инстилляции IL-13 в легкие и у трансгенных мышей IL-13 (93, 94, 98, 99).Таким образом, сигналы цитокинов Th3 служат для регулирования экспрессии гена CLCA в различных условиях. Этот стимулирующий эффект IL-13 может зависеть от сайтов связывания Stat6 в промоторе гена CLCA, но точный биохимический механизм еще предстоит определить.

    clcA - H (+) / Cl (-) обменный переносчик ClcA - Escherichia coli (штамм K12)

    18

    18

    18

    Этот подраздел «Патология и биотехнология» описывается влияние экспериментальной мутации одной или нескольких аминокислот на биологические свойства белка. p> Подробнее ...

    Мутагенез i
    Функциональный ключ Позиция (я) Описание Действия Графическое изображение Длина
    107 S → A: отделяет транспорт хлоридов от транспорта протонов.

    Ручное утверждение, основанное на эксперименте в i

    1
    Мутагенез i 148 E → A или Q: отменяет транспорт протонов, но разрешает транзит хлорид-ионов.Отменяет стробирование, обеспечивая непрерывный быстрый переход ионов хлора; когда связан с А-445.

    Ручное утверждение, основанное на эксперименте в i

    • Процитировано для: ХАРАКТЕРИСТИКА, ФУНКЦИЯ, МУТАГЕНЕЗ GLU-148.

    • Процитировано для: РЕНТГЕНОВСКАЯ КРИСТАЛЛОГРАФИЯ (2,51 АНГСТРОМА) 17-460 МУТАНТОВ ALA-148 И GLN-148 В КОМПЛЕКСЕ С ХЛОРИДОМ, МУТАГЕНЕЗ GLU-148.
    • Процитировано для: РЕНТГЕНОВСКАЯ КРИСТАЛЛОГРАФИЯ (3.1 АНГСТРОМЫ), ФУНКЦИЯ, ИОН-СВЯЗЫВАЮЩИЕ УЧАСТКИ, МУТАГЕНЕЗ SER-107; ГЛУ-148 И ТИР-445.

    • Процитировано для: РЕНТГЕНОВСКАЯ КРИСТАЛЛОГРАФИЯ (2,8 АНГСТРОМА) МУТАНТА ALA-148 / ALA-445, ФУНКЦИЯ, СУБЪЕКТ, МУТАГЕНЗ GLU-148 И TYR-445.

    1
    Мутагенез i 203 E → A, G, Q, S или T: устраняет транспорт протонов и снижает транспорт хлоридов.

    Ручное утверждение, основанное на эксперименте в i

    1
    Мутагенез i 203 E → C, I, L или V: Прекращает перенос протонов и хлоридов.

    Ручное утверждение, основанное на эксперименте в i

    1
    Мутагенез i 203 E → D или H: не влияет на транспорт протонов и хлоридов.

    Ручное утверждение, основанное на эксперименте в i

    1
    Мутагенез i 203 E → K или R: Снижение транспорта протонов и хлоридов.

    Ручное утверждение, основанное на эксперименте в i

    1
    Мутагенез i 445 Y → A: Отменяет стробирование, разрешая непрерывный быстрый транзит хлорид-ионов; когда связан с А-148.

    Ручное утверждение, основанное на эксперименте в i

    • Процитировано для: РЕНТГЕНОВСКАЯ КРИСТАЛЛОГРАФИЯ (3.1 АНГСТРОМЫ), ФУНКЦИЯ, МЕСТО СВЯЗИ ИОНА, МУТАГЕНЕЗ SER-107; ГЛУ-148 И ТИР-445.

    • Процитировано для: РЕНТГЕНОВСКАЯ КРИСТАЛЛОГРАФИЯ (3,3 АНГСТРОМА), МУТАГЕНЕЗ TYR-445.

    • Процитировано для: РЕНТГЕНОВСКАЯ КРИСТАЛЛОГРАФИЯ (2,8 АНГСТРОМА) МУТАНТА ALA-148 / ALA-445, ФУНКЦИЯ, СУБЪЕКТ, МУТАГЕНЗ GLU-148 И TYR-445.

    1
    Мутагенез i 445 Y → F или W: Нет эффекта.

    Ручное утверждение, основанное на эксперименте в i

    • Процитировано для: РЕНТГЕНОВСКАЯ КРИСТАЛЛОГРАФИЯ (3.1 АНГСТРОМЫ), ФУНКЦИЯ, МЕСТО СВЯЗИ ИОНА, МУТАГЕНЕЗ SER-107; ГЛУ-148 И ТИР-445.

    • Процитировано для: РЕНТГЕНОВСКАЯ КРИСТАЛЛОГРАФИЯ (3,3 АНГСТРОМА), МУТАГЕНЕЗ TYR-445.

    • Цитируется по: РЕНТГЕНОВСКАЯ КРИСТАЛЛОГРАФИЯ (2.8 АНГСТРОМЫ) МУТАНТА ALA-148 / ALA-445, ФУНКЦИЯ, СУБЪЕКТ, МУТАГЕНЕЗ GLU-148 И TYR-445.

    1
    Мутагенез i 445 Y → L: изменяет стехиометрию протонно-хлоридного обмена.

    Ручное утверждение, основанное на эксперименте в i

    • Процитировано для: РЕНТГЕНОВСКАЯ КРИСТАЛЛОГРАФИЯ (3.1 АНГСТРОМЫ), ФУНКЦИЯ, МЕСТО СВЯЗИ ИОНА, МУТАГЕНЕЗ SER-107; ГЛУ-148 И ТИР-445.

    • Процитировано для: РЕНТГЕНОВСКАЯ КРИСТАЛЛОГРАФИЯ (3,3 АНГСТРОМА), МУТАГЕНЕЗ TYR-445.

    • Процитировано для: РЕНТГЕНОВСКАЯ КРИСТАЛЛОГРАФИЯ (2,8 АНГСТРОМА) МУТАНТА ALA-148 / ALA-445, ФУНКЦИЯ, СУБЪЕКТ, МУТАГЕНЗ GLU-148 И TYR-445.

    1

    openxpki / clca: ЦС командной строки, включая загрузочный носитель корневого ЦС и общий доступ к секретам

    Авторские права (c) 2004-2018 Мартин Бартош, WhiteRabbitSecurity GmbH

    Это программное обеспечение распространяется под Стандартной общественной лицензией GNU - см. сопроводительный файл ЛИЦЕНЗИИ для получения более подробной информации.

    Введение

    Это набор инструментов, которые позволяют использовать базовую инфраструктуру PKI. такие операции, как выдача сертификата Sub CA (подписание сертификата запросы), отзыв сертификата и выдача CRL. Скрипт изначально был разработан для использования в корневом центре сертификации, но может также может использоваться для центров сертификации нижнего уровня или даже для сертификатов конечных объектов.

    Закрытые ключи

    CA могут храниться в зашифрованных файлах (зашифрованных с помощью простую парольную фразу или с помощью Shamir's Secret Sharing) или хранятся в HSM.

    Скрипт был успешно протестирован с

    • Thales nCipher nShield HSM
    • Gemalto SafeNet Luna SA HSM

    Обратите внимание, что этот сценарий не поддерживает одновременное использование несколько сеансов. Следует ожидать непредсказуемого поведения, если два экземпляры сценария CA выполняются одновременно.

    Быстрый старт: создание CA

    С помощью этого сценария можно обрабатывать произвольное количество экземпляров CA.

    • Для каждого CA создайте новый каталог верхнего уровня и перейдите в этот каталог.В этом каталоге создайте каталог etc и скопируйте содержимое каталога sample etc из дистрибутива CLCA.

    • Измените конфигурацию CA etc / clca.cfg в соответствии со своими потребностями. Задавать ENGINE, если требуется для поддержки HSM или программного обеспечения CA.

    • Измените etc / openssl.cnf в соответствии с политикой вашего центра сертификации и сертификатом. профиль (см. «Конфигурация»)

    • Создать корневой ключ (см. «Генерация корневого ключа»)

    • Создать самозаверяющий сертификат ЦС ИЛИ

    • Создать запрос сертификата ЦС, экспортировать его в ЦС более высокого уровня и импортировать сертифицированный сертификат CA

    Генерация корневого ключа

    Требуется только для поддержки nCipher HSM:

    • Установите модуль nCipher и программное обеспечение.
    • Создайте мир безопасности
    • Создание набора карточек администратора
    • Создайте набор карт оператора, защищающий ваш корневой ключ
    • Создайте корневой ключ с помощью generatekey2 hwcrhk

    Требуется только для поддержки HSM Gemalto SafeNet Luna SA:

    • Установить драйверы HSM
    • Установить доверительную ссылку на Luna SA HSM
    • Получите документ поддержки Gamalto SafeNet DOW4073 (или более новый документ, содержащий OpenSSL драгоценный двигатель)
    • Установите OpenSSL Engine и инструмент командной строки sautil

    Требуется только для программной поддержки CA с простой парольной фразой:

    • создать частный каталог в $ CA_HOME
    • адаптирует имя ключа RSA в clca.cfg
    • запустить openssl genrsa -des3 $ CA_HOME / private /

    См. README.keyceremony-shared-interactive.md для примера использования совместного использования секретов.

    Конфигурация

    Отредактируйте etc / clca.cfg и etc / openssl.cnf в соответствии с вашими потребностями, в частности, профиль сертификата и другие параметры политики.

    Обратите внимание, что инициализация CA заботится об установке правильные пути в openssl.cnf, поэтому ручное изменение не необходимо для этого раздела.

    Базовое использование и получение помощи

    Система CA содержится в одном скрипте ( bin / clca ). Если вызывается без аргументов, он печатает обзор поддерживаемых команды. Чтобы получить онлайн-справку по определенной команде, используйте

    $ clca help КОМАНДА или $ clca КОМАНДА - помощь

    Ввод PIN-кода

    Если используется HSM, ввод PIN-кода обычно обрабатывается командой предварительной загрузки. который, в свою очередь, вызывает OpenSSL. Таким образом, конфигурационная переменная HSM_PRELOAD должен быть установлен на соответствующий исполняемый файл, который позволяет открывать HSM для операций с закрытым ключом.

    Инициализация CA

    Перед использованием системы необходимо создать центр сертификации. Это необходимо только однажды.

    Для первоначальной настройки нового центра сертификации необходимо выполнить следующие действия:

    Убедитесь, что настройки etc / clca.cfg и etc / openssl.cnf в порядке.

    Бег

    $ clca initialize --startdate DATESPEC --enddate DATESPEC

    Скрипт выполняет несколько проверок работоспособности и отказывается перезаписывать существующий центр сертификации.Если сертификаты ЦС были удалены вручную из каталога ca / ​​ автоматически создается резервная копия существующего центра сертификации. в каталог attic / и создается новый центр сертификации.

    Дата начала и дата окончания указаны в часовом поясе UTC. Обратите внимание, что год должен быть указан только двумя цифрами!

    Дата / время могут быть указаны в усеченной форме, опуская любое количество «правых» компонентов даты / времени (например, «ГГММ»).

    Выполните clca help datepec для получения дополнительных сведений о спецификации даты.

    Если вы не используете HSM, вам будет предложено ввести PIN-коды, защищающие закрытый ключ CA во время создания CA.

    После настройки CA обязательно сделайте резервную копию ключа CA и база данных сертификатов. Если ключ утерян, новых сертификатов или списков отзыва сертификатов не будет. может быть оформлен.

    Подписание запросов на сертификат

    Позвонить

    $ clca certify --profile PROFILE [--startdate DATESPEC --enddate DATESPEC] <файл запроса>

    для подтверждения запроса PKCS # 10.Формат запроса (DER / PEM) определяется автоматически.

    Обратите внимание, что --profile является обязательным и должен ссылаться на раздел в openssl.cnf файл, который содержит ссылку x509_extensions и НЕ содержит отличительного_имя или ссылка crl_extensions.

    Можно переопределить DN субъекта и добавить в запрос SubjectAlternativeNames. За подробностями обращайтесь к тексту справки по команде.

    Параметры startdate и enddate являются необязательными и указываются в часовом поясе UTC.Обратите внимание, что год необходимо указывать только двумя цифрами!

    Дата / время могут быть указаны в усеченной форме, опуская любое количество «правых» компонентов даты / времени (например, «ГГММ»).

    Выполните clca help datepec для получения дополнительных сведений о спецификации даты.

    Если начальная / конечная дата не указана, используется действительность по умолчанию из профиля.

    Пропуск начальной и конечной даты рекомендуется только для сертификатов конечных объектов, используйте явную действительность для любого сертификата, который используется в качестве CA.

    Полученный сертификат помещается в каталог certs /. Копия самого последнего сертификата также записывается в newcert.pem в текущий рабочий каталог.

    Отзыв сертификатов

    Для отзыва сертификата звоните

    $ clca revoke <серийный номер>

    Это позволит идентифицировать сертификат в базе данных сертификатов (certs / каталог) и отметьте сертификат как отозванный.

    Листинговые свидетельства

    Звонок

    $ clca list <фильтр>

    перечисляет все сертификаты, соответствующие указанному фильтру.Фильтр может быть пустым, либо «действительным», либо «отозванным». Если фильтр не указан, все сертификаты распечатываются по стандарту

    .

    Выдача CRL

    Для создания нового списка отзыва сертификатов

    $ clca issue_crl

    Это создаст новый CRL и запишет его в каталог crls / ГГГГММДДЧЧММСС.crl . (Заглавные буквы заменяются на текущая отметка времени.)

    Срок действия CRL настраивается в файле etc / openssl.cnf.

    Вход по ключу CA

    Если несколько команд clca должны выполняться подряд (например,г. для подписания нескольких сертификатов) можно ввести подоболочку, в которой кэшируется ключевая фраза-пароль CA.

    Работает

    $ clca логин

    сначала запросит ключевую фразу CA, а затем перейдет в подоболочку. Можно выполнить любое количество команд clca, для которых требуется кодовая фраза CA, без повторного ввода ключевой фразы.

    Введите exit , чтобы покинуть эту оболочку.

    Проверка целостности программного обеспечения

    Проверка целостности конфигурации и всех необходимых внешних программ можно выполнить, запустив

    $ clca чек

    Эта команда сообщит индивидуальные контрольные суммы для конфигурации. файлы и одна составная контрольная сумма для всех внешних утилит UNIX используется сценарием.

    Создание резервных копий ЦС

    В любой момент можно создать снимок текущего статуса CA, включая базу данных сертификатов, состояние отзыва и все связанные данные (включая закрытые ключи, если HSM не используется).

    Для создания такой резервной копии просто запустите

    $ clca backup [имя файла]

    Это создаст резервную копию tar, сжатую gzip, в текущем каталоге. с именем YYYYMMDDHHMMSS-ca-backup.tar.gz , если имя файла не указано, в противном случае будет создан указанный файл.

    Эта резервная копия содержит всю информацию для восстановления CA на состояние, в котором он находился, когда была запущена команда резервного копирования. Чтобы восстановиться к этому просто сотрите каталог $ CA_HOME и извлеките желаемый резервный архив. Это восстановит файл конфигурации, исполняемый файл ca и база данных сертификатов.

    C.L. Деллумс: герой за гражданские права Окленда

    Благодаря нашему архивисту Шону из Афроамериканского музея и библиотеки в Окленде у нас есть увлекательная запись в блоге о К.Л. Деллумс, житель Окленда, о котором вам следует знать.

    Спасибо Шону, архивариусу Афроамериканского музея и библиотеки в Окленде за этот удивительный пост. Вы слышали о C.L. Деллумс?

    Когда C.L. (Коттрелл Лоуренс) Деллумс прибыл в Окленд, штат Калифорния, в 1923 году, он мечтал однажды поступить на юридический факультет Калифорнийского университета. Он приехал в Калифорнию по тем же причинам, по которым в штат приехали другие афроамериканцы - чтобы избежать сегрегации и расизма Юга в надежде обрести социальное и экономическое равенство.

    Но Деллумс вскоре понял, что дела в Калифорнии мало чем отличаются от Техаса, и единственными вакансиями, открытыми для афроамериканцев, были низкооплачиваемые должности в сфере обслуживания, такие как официанты, дворники, рабочие и носильщики на железной дороге. В конце концов Деллумс нашел работу носильщика на железной дороге в компании Pullman, планируя использовать свою зарплату в качестве носильщика для финансирования своего обучения. Он быстро понял, что его зарплата и график работы носильщиком не позволяют ему ходить в юридический институт, и был потрясен многочисленными несправедливостями, от которых страдали те, кто работал в поездах.К 1925 году К. Деллумс устал от неадекватной зарплаты и часто унизительных условий труда. Он призвал своих коллег-носильщиков присоединиться к нему в борьбе за лучшие условия труда. С прибытием А. Филипа Рэндольфа в Окленд осенью 1925 года Деллумс обнаружил средство для достижения своих целей - недавно созданное Братство носильщиков спящих вагонов (BSCP).

    Деллумс провел большую часть следующих 65 лет своей жизни, защищая и борясь за лучшие условия труда для носильщиков в составе Братства.После того, как он был уволен компанией Pullman в 1927 году за его профсоюзную деятельность с Братством, он продолжил свою работу с BSCP и был назначен директором операций BSCP на Западном побережье и национальным вице-президентом в 1929 году. Деллумс и BSCP будут выиграть множество битв за заработную плату и условия труда, и компания Pullman в конечном итоге была официально признана руководством компании в 1937 году.

    В дополнение к работе с профсоюзами Деллумс также тесно сотрудничал с общественными организациями и законодательными органами в борьбе за гражданские права.Он был избран первым председателем отделения округа Аламеда N.A.A.C.P. и руководил многими группами усилий по обеспечению справедливого жилья и занятости в соответствии с законодательством. После того, как четырем студентам из Государственного сельскохозяйственного и технического университета Северной Каролины было отказано в обслуживании за обеденным столом в универмаге Woolworth в Гринсборо, Северная Каролина, Деллумс возглавил бойкот и протест против магазинов Kress и Woolworth в районе залива. Неутомимый защитник прав рабочих и афроамериканцев, Деллумс активно сотрудничал с организациями и союзами гражданских прав до своей смерти в 1989 году в возрасте 89 лет.

    Афроамериканский музей и библиотека в Окленде недавно завершил проект оцифровки документов Коттрелла Лоуренса, доступных в Интернете. Сборник служит отличным ресурсом для студентов и общественности, чтобы узнать о важной роли К.Л. Деллумс сыграл в истории гражданских прав афроамериканцев в Калифорнии и Братства носильщиков спящих машин.

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *