Рубрика: Разное

Серия Taylor | Encyclopdia Britannica, Inc. (nd)

Пример ряда Тейлора | Tutorial.math.lamar.edu (n.d.)
 

Калькулятор интегралов с шагами

Калькулятор интегралов с шагами

Калькулятор первообразных (интегралов) — это онлайн-инструмент, используемый для расчета первообразных с шагами. Этот интегральный калькулятор интегрирует функции относительно переменной, т. е. x, y, z, u или t.

Этот интегральный калькулятор вычисляет выражения неопределенного интеграла, а также определенного интеграла с шагом.

В случае определенного интеграла этот интегральный калькулятор использует верхний и нижний пределы заданной функции. Верхний и нижний пределы – это максимальное и минимальное значения интервалов.

Как работает первообразный калькулятор

?

Вы можете вычислить интегралы, выполнив следующие действия.

• Выберите метод, т. е. определенный или неопределенный.
• Выберите переменную.
• Заполните поля верхнего и нижнего пределов в случае определенного интеграла.
• Запишите функцию в поле ввода.
• Используйте значок клавиатуры для ввода математических ключей.
• Нажмите кнопку вычислить . Вы получите вывод данной функции с пошаговым расчетом.
• Нажмите показать больше , чтобы увидеть пошаговое решение.
• Нажмите кнопку сброса , чтобы войти в новую функцию.

Что такое интеграл?

В математике интеграл присваивает числа функциям таким образом, который описывает площадь, объем, перемещение и другие понятия, возникающие при объединении бесконечно малых данных. Процесс нахождения интеграла называется интегрированием.

В уравнении интеграла используются три члена:

1. Знак интегрирования
2. Интеграл (функция, подлежащая интегрированию)
3. Переменная интегрирования

Уравнение интеграла приведено ниже.

\(\int f\left(x\right)dx\)

Типы интегралов:

• Двойной интеграл
• Тройной интеграл
• Несобственный интеграл

 4 Правила интегрирования 903 перечислены в таблице.

Как вычислять интегралы?

Используя определенные и неопределенные интегралы, мы можем легко вычислить первообразные заданных функций. Ниже приведены некоторые примеры, которые оцениваются нашим интегральным калькулятором. Пример 1: Для неопределенного интеграла . 92x ½(x+sin(x)cos(x)) + c

Ссылки

• Wikimedia Foundation | Что такое интеграл? Википедия.
• Правила интеграции | Исследование.com | Пройдите онлайн-курсы. Заработайте кредит колледжа.

Калькулятор пределов (решение) — Con pasos

Калькулятор пределов с расчетом

Калькулятор пределов le ayuda encontrar el límite de una función con respecto a una Variable. Es уна herramienta ан línea дие ло ayuda исчисление эль доблесть де уна función cuando уна entrada себе acerca ип доблесть específico.

 La Calculadora de limites con pasos muestra la solucion paso a paso de los límites junto con una grafica y una expansión en serie. Emplea todas las reglas de límite, como la suma, el producto, el cociente y la regla de L’hopital para calcular el valor correcto.

Вы можете оценить ограничения, связанные с \(\text{x, y, z, v, u, t}\) y \(w\), которые используются для расчета ограничений.

Нет ЕСО. Mediante el uso de esta herramienta, también puede encontrar,

1. Предельный предел (+)
2. Предельный предел (-)
3. Двусторонний предел

¿Cómo funciona la Calculadora de limites?

Para evaluar el límite usando este solucionador de límites, siga los pasos a continuación.

• Ingrese la función en el cuadro de entrada Dado.
• Выбор корреспонденции переменной.
• Introduzca el valor límite.
• Элиге-эль-ладо-дель-лимит. es decir, izquierda, derecha o de dos caras.
• Pulse el botón Расчетный пункт для получения результатов.
• Используйте el botón Reiniciar para ingresar nuevos valores y el icono de teclado  para ingresar valores adicionales.

Encontrará la respuesta debajo de la herramienta. Haga clic en Mostrar pasos para ver la solución paso a paso.

¿Qué es un limit en cálculo?

El limite de una función es el valor al que f(x) se acerca a medida que x se acerca a algún número. Los límites себе pueden usar para definir las derivadas, lasintegres y la continuidad al encontrar el límite de una función Dada. Está escrito como: 9x tiende a 0 es 1.

¿Cuál es el límite cuando x tiende al infinito de ln(x)?

Ограничение, которое может длиться до бесконечности, как ln(x) es +∞. El límite de este logaritmo natural puede demostrarse por reductio ad absurdum.

• Si x >1ln(x) > 0, el límite debe ser positivo.

• Como ln(x2) − ln(x1) = ln(x2/x1). Si x2>x1, la diferencia es positiva, por lo que ln(x) siempre es creciente.

• Si lim x→∞ ln(x) = M ∈ R, тенемос ln(x)

Калькулятор пределов со свободными шагами

Этот калькулятор пределов серии вычисляет положительные или отрицательные пределы для заданной функции в любой точке. Вы должны попробовать этот решатель лимитов, чтобы определить, как легко решать лимиты. Кроме того, этот калькулятор правила Лопиталя помогает вычислять предельные задачи \(\frac{0}{0}\) и \(\frac{\infty}{\infty}\) и поддерживает вычисление пределов на положительных и отрицательных бесконечностях.

Что ж, читайте дальше, чтобы получить представление о том, как найти предел функции с помощью этого оценщика пределов. Начнем с основ!

Что такое предельная математика?

Его можно определить как:

«Значение, к которому функция «приближается» как входное «приближается» к некоторому значению».

Предельное обозначение представляет собой математическую концепцию, основанную на идее близости. Необходимо оценить предел в исчислении либо калькулятором предела исчисления, либо вручную. Калькулятор определения пределов присваивает значения определенным функциям в точках, где значения не определены. Все это делается таким образом, чтобы соответствовать ближайшим или близким значениям.

В большинстве курсов исчисления мы работаем с пределом, что означает, что легко начать думать, что предел исчисления всегда существует. С другой стороны, это также помогает решить предел по правилу Лопиталя, что будет объяснено ниже.

Что ж, онлайн-калькулятор производной — лучший способ вычислить производную функции по заданным значениям и показать дифференцирование, что является важным аспектом калькулятора l’hopital при нахождении пределов.

Уравнение ограничения:

Теперь вы можете легко вычислить пределы любых функций, используя формулу, которая также используется калькулятором пределов и приведена ниже:

$$ \lim_{x \to a}f(x)=L $$

Пример Описание:

Если у вас есть функция \(\frac {(x2 − 1)} {(x − 1)}\), то необходимо найти пределы, когда x равно 1, так как деление на ноль не является законным математическим операция. С другой стороны, для любого другого значения x числитель можно учесть, а также разделить на (x-1), чтобы получить x+1. Таким образом, это частное будет равно x+1 для всех значений x, кроме 1, которая не имеет значения. Однако 2 можно присвоить функции \(\frac {(x2 − 1)} {(x − 1)}\) в качестве ее предела, когда x приближается к 1. Если предел x приближается к 0 или бесконечности, такие вычисления могут быть упрощается с помощью калькулятора правила Лопиталя с шагами.

Для определения пределов существуют определенные законы и калькуляторы пределов, которые используют правила исчисления для определения предела функции. Кроме того, бесплатный онлайн-калькулятор интегралов позволяет определить интегралы функции, соответствующей задействованной переменной, и показывает пошаговую работу.

Законы лимита:

Этот лучший калькулятор лимов с шагами работает, анализируя различные операции лимитов. Эти законы можно использовать для оценки предела полиномиальной или рациональной функции. Кроме того, для некоторых правил существуют определенные условия, и если они не выполняются, правило нельзя использовать для проверки оценки ограничения. Однако использование оценщика пределов — лучший способ оценить пределы функции в любой точке.

В следующей таблице приведены предельные законы вместе с некоторыми основными свойствами.

	Предельный закон в символах	Предельный закон прописью
1	\( \lim_{x \to a} [f(x) + g(x)] = \lim_{x \to a}f(x) + \lim_{x \to a}g(x)\)	Сумма лимитов равна лимиту суммы.
2	\(\lim_{x \to a}[ f(x) – g(x)]= \lim_{x \to a} f(x) – \lim_{x \to a} g(x)\)	Разность пределов равна пределу разности.
3	\( \lim_{x \to a} cf (x) = c \lim_{x \to a} f (x) \)	Постоянное время предел функции равен пределу постоянного времени функции.
4	\(\lim_{x \to a}[ f(x)g(x)] = \lim_{x \to a} f(x) × \lim_{x \to a} g(x)]\)	Произведение пределов равно пределу произведения.
9н\)	Где значение \( n\) является положительным целым числом, а если \( n \) четным.

Как оценить лимиты?

Существуют различные способы определения лимитов, одним из лучших из которых является бесплатный калькулятор l’hopital. Но здесь мы будем разрабатывать каждый из них один за другим. Пойдем!

Метод подстановки:

В этом методе нам необходимо подставить значение лимита в функцию для оценки лимита. Вы также можете сделать это быстро, воспользовавшись этим онлайн-калькулятором лимита оценки. Как это звучит для вас?

Метод факторинга:

В этом методе вам нужно сделать множители, чтобы одинаковые условия можно было аннулировать. И когда есть оставшиеся термины, вы должны применить к ним ограничения в соответствии с правилом.

Правило Лопиталя:

Это действительно один из наиболее важных методов, используемых для оценки пределов в форме \(\frac{0}{0}\) или \(\frac{\inf}{ \инф}\). Чтобы применить этот метод, необходимо учитывать следующие моменты:

• Во-первых, следуйте методу замены, чтобы оценить предел. Если это приводит к \(\frac{0}{0}\) или \(\frac{\inf}{\inf}\), вам необходимо применить это правило. Еще одна легкость здесь заключается в том, что этот бесплатный калькулятор правил больниц занимает пару минут, чтобы распознать, является ли данная функция неопределенной или нет.
• Теперь, когда вы получите форму, как определено выше, вам нужно дифференцировать функцию.
  После этого вы должны применить метод подстановки, чтобы найти предел данной функции.

Для лучшего приближения мы узнаем, как находить пределы, используя этот конкретный способ в примере позже.

Метод сопряжения:

В этом методе чаще всего встречаются комплексные числа. Теперь наш совет заключается в том, чтобы определить сопряжение данного числа. После того, как вы это сделаете, вам нужно упростить его и использовать этот калькулятор бесконечных пределов для определения границ любой функции.

Бесконечный предел и рациональная функция:

Функция, которую можно записать в виде отношения двух многочленов:

$$ f(x) = \frac {P(y)} {Q(y)} $$

Мы можем найти предел функции 0, Inf, -Inf или вычислить по коэффициентам.

Как рассчитать пределы?

Как насчет решения нескольких примеров, чтобы понять, как вы используете различные методы для упрощения ограничений? Давайте погрузимся в это!

Пример № 01:

Оцените предел функции ниже:

$$ \lim_{x \to 13} \frac {x} {5} $$

Решение:

Здесь мы будем использовать метод подстановки:

$$ \lim_{x \to 13 } \frac {x} {5} $$

Положим x = 3;

$$ \lim_{x \to 13} \frac {x} {5} = \frac{13}{5} $$

$$ \lim_{x \to 13} \frac {x} {5 } = 2. 2} {y-2} $$ 92 – 4 } {y – 2} $$

$$ = \lim_{y \to 2} \frac {(y-2) (y + 2)} {(y-2)} $$

Теперь подставляя у = 2;

$$ \lim_{y \to 2} ( y + 2 ) $$

$$ 2+2 = 4 $$

Вы также можете перепроверить все ответы, используя этот лучший калькулятор поиска предела в мерцание мгновений.

Пример № 03:

Как ограничить функцию, указанную ниже:

$$ \lim_{x \to 0} \left(\frac{sin x}{x}\right) $$

Решение:

Используя метод подстановки:

$$ \lim_{x \to 0} \left(\frac{sin x}{x}\right) $$

$$ = \frac{sin 0 {0} $$

$$ = \frac{0}{0} $$

Это неопределенная форма. Итак, здесь мы будем применять правило Лопиталя:

Прежде чем двигаться дальше, мы должны проверить, являются ли обе функции выше и ниже винкулума дифференцируемыми или нет.

$$ \frac{d}{dx} \left(sin x\right) = cos x $$

$$ \frac{d}{dx} \left(x\right) = 1 $$

Двигаемся дальше:

$$ \lim_{x \to 0} \left(\frac{cos x}{1}\right) $$

$$ = \frac{cos 0}{1} $$

$$ = 1 $$

Чтобы ускорить вычисления, попробуйте воспользоваться калькулятором правил l’Hospital.

Пример #04:

Как найти предел следующей функции:

$$ \lim_{z \to 9} \frac {3 – \sqrt {z}} {9 – \sqrt {z }} $$

Решение:

Если значение z равно 92} {( 9 – z ) (3 + \sqrt {z})} $$

$$ = \frac {( 9 – z )} {( 9 – z ) (3 + \sqrt {z})} $$

$$ = \frac {1} { 3 + \sqrt {z} } $$

$$ \lim_{z \to 9} \frac { 3 + \sqrt {z} } { 9 – z } $$

После отмены 9-z;

$$ \lim_{z \to 9} \frac {1} { 3 + \sqrt {z} } $$

$$ = \frac {1} { 3 + \sqrt {9} } $$

$$ = \frac {1} { 3 + 3 } $$

$$ = \frac {1} {6} $$

Как калькулятор лимитов вычисляет лимиты?

Графический калькулятор пределов позволяет оценить предел заданных переменных. Что ж, искатель пределов помогает найти пределы, выполнив указанные шаги:

Ввод:

• Прежде всего, введите уравнение или функцию.
• Выберите из раскрывающегося списка переменную, для которой необходимо оценить предел. Это может быть x,y,z,a,b,c или n.
• Укажите число, по которому вы хотите рассчитать лимит. В этом поле вы также можете использовать простое выражение, такое как inf=∞ или pi =π.
• Теперь выберите направление ограничения. Может быть как положительным, так и отрицательным
• После того, как вы введете значения в данные поля, калькулятор выдаст вам предварительный просмотр уравнения.
• Нажмите кнопку расчета.

Вывод:

Калькулятор оценки свободных пределов выполняет следующие вычисления:

• Определяет пределы заданной функции
• Показать пошаговые расчеты
• Представляет разложение в ряд Тейлора для заданной функции

Часто задаваемые вопросы:

Как узнать, что ограничения не существует?

Чтобы найти предел на графике, если есть вертикальная асимптота и одна сторона стремится к бесконечности, а другая — в направлении отрицательной бесконечности, то предела не существует. Точно так же, если в графе есть дыра при значении x c, двустороннего предела не будет. Тем не менее, определитель пределов может помочь вам более точно оценить пределы.

Что такое правильное обозначение предела?

По сути, предельное обозначение — это способ сформулировать деликатную идею, а не просто сказать, что x=5 или y=3 \(\lim_{x \to a} f(x)=b\) С другой стороны, единица Калькулятор двусторонних пределов избавляет от беспокойства по поводу обозначений пределов, поскольку он решает пределы и указывает их неточное форматирование.

Можно ли применить правило Лопиталя ко всем пределам?

Правило Лопиталя используется с неуказанными пределами, которые имеют форму 0/0 или бесконечность. Это не устраняет все виды ограничений. Иногда даже повторное применение правила не может помочь найти предельные значения. Итак, для удобства калькулятор правила Лопиталя — лучший способ решения бесконечных пределов функций.

Может ли 0 быть пределом?

Если мы просто вычисляем предел уравнения 0/0, он не будет определен. Однако, если мы получим 0/0, тогда может быть ряд ответов. Теперь единственный способ определить точный ответ — использовать решатель пределов для точного определения предельных задач.

Как пределы используются в расчетах?

Пределы определяют, как функция будет действовать вблизи точки, а не в этой точке. Эта идея лежит в основе исчисления. Например, пределом «f» при x=3 является значение f по мере того, как мы все ближе и ближе приближаемся к x=3. Это также можно было бы получить, подвергнув это лучшему калькулятору пределов.

Заключение:

Этот онлайн-калькулятор лимитов находит лимиты и, в частности, работает для решения лимитов по отношению к переменной. Пределы можно оценивать как с положительной, так и с отрицательной стороны. Он обслуживает все предельные задачи, которые невозможно решить алгебраически. Таким образом, здорово помочь студентам и профессионалам решить и проверить свои пределы в мгновение ока.

Ссылки:

Из официального источника Википедии: Предел (математика), функция, последовательность, стандартные детали и многое другое!

Источник Академии Хана предоставляет: Лучшая стратегия в поиске пределов

Из источника tutorial. math: Все, что вам нужно знать о приближении к пределу

Другие языки: Предел Hesaplama, Предел калькулятора, Гренцвертрехнер, Предел Калкулачка, Калькулятор пределов, Калькулятор пределов, Калькулятор пределов, Калькулятор пределов, Калькулятор Пределов.

Исчисление I. Пределы вычислений

Показать мобильное уведомление Показать все примечания Скрыть все примечания

Мобильное уведомление

Похоже, вы используете устройство с «узкой» шириной экрана ( т. е. вы, вероятно, используете мобильный телефон). Из-за характера математики на этом сайте лучше всего просматривать в ландшафтном режиме. Если ваше устройство не находится в ландшафтном режиме, многие уравнения будут отображаться сбоку вашего устройства (должна быть возможность прокрутки, чтобы увидеть их), а некоторые пункты меню будут обрезаны из-за узкой ширины экрана.

Раздел 2-5: Расчетные ограничения

В предыдущем разделе мы видели, что существует большой класс функций, который позволяет нам использовать

. \[\ mathop {\lim }\limits_{x \to a} f\left( x \right) = f\left(a \right)\]

для вычисления лимитов. Тем не менее, есть также много ограничений, для которых это не будет легко работать. Цель этого раздела — разработать методы работы с некоторыми из этих ограничений, которые не позволят нам просто использовать этот факт.

Давайте сначала вернемся и посмотрим на один из первых пределов, которые мы рассмотрели, вычислим его точное значение и проверим наше предположение относительно предела. 92} — 2x}} & = \mathop {\lim }\limits_{x \to 2} \frac{{\left({x — 2} \right)\left({x + 6} \right)}} {{x\left( {x — 2} \right)}}\\ & = \mathop {\lim }\limits_{x \to 2} \frac{{x + 6}}{x}\end{align *}\]

Итак, разложив на множители, мы увидели, что можем сократить \(x — 2\) как в числителе, так и в знаменателе. После этого у нас теперь есть новое рациональное выражение, в которое мы можем подставить \(x = 2\), потому что мы потеряли проблему деления на ноль. Следовательно, предел равен 9.2} — 2x}} = \ mathop {\ lim } \ limit_ {x \ to 2} \ frac {{x + 6}} {x} = \ frac {8} {2} = 4 \]

Обратите внимание, что на самом деле это то, что мы предполагали.

Прежде чем закончить этот пример, давайте обсудим тот факт, что мы не могли подставить \(x = 2\) в наш первоначальный предел, но как только мы сделали упрощение, мы просто подставили \(x = 2\), чтобы получить ответ. На первый взгляд может показаться, что это противоречие.

В исходном пределе мы не могли подставить \(x = 2\), потому что это давало нам ситуацию 0/0, с которой мы ничего не могли сделать. Сделав упрощение, мы можем заметить, что 92} — 2x}} = \frac{{x + 6}}{x}\hspace{0,25 дюйма}{\mbox{при условии}}x \ne 2\]

Другими словами, два уравнения дают одинаковые значения, за исключением точки \(x = 2\), а поскольку пределы касаются только того, что происходит вокруг точки \(x = 2\), предел двух уравнений будет равен равный. Что еще более важно, в упрощенной версии мы получаем «достаточно хорошее» уравнение, и поэтому то, что происходит вокруг \(x = 2\), идентично тому, что происходит при \(x = 2\).

Таким образом, мы можем взять предел упрощенной версии, просто подставив \(x = 2\), даже если мы не смогли подставить \(x = 2\) в исходное уравнение, а значение предела упрощенной версии уравнение будет таким же, как предел исходного уравнения.

Кстати, 0/0, которое мы изначально получили в предыдущем примере, называется неопределенной формой . Это означает, что мы на самом деле не знаем, что это будет, пока не проделаем дополнительную работу. Как правило, ноль в знаменателе означает, что он не определен. Однако это будет верно только в том случае, если числитель не равен нулю. Кроме того, ноль в числителе обычно означает, что дробь равна нулю, если только знаменатель также не равен нулю. Точно так же все, что делится само на себя, равно 1, если только мы не говорим о нуле.

Итак, здесь действительно три конкурирующих «правила», и непонятно, какое из них победит. Также возможно, что ни один из них не выиграет, и мы получим что-то совершенно отличное от undefined, нуля или единицы. Мы могли бы, например, получить из этого значение 4, чтобы выбрать число совершенно случайно.

При простом вычислении уравнения 0/0 не определено. Однако, принимая предел, если мы получаем 0/0, мы можем получить множество ответов, и единственный способ узнать, какой из них правильный, — это фактически вычислить предел. 92}}}{h}\\ & = \mathop {\lim }\limits_{h \to 0} \frac{{h\left( { — 12 + 2h} \right)}}{h}\\ & = \ mathop {\ lim} \ limit_ {h \ to 0} \, \, — 12 + 2h = — 12 \ end {align *} \]

Пример 3 Оцените следующий предел. \[\ mathop {\lim }\limits_{t \to 4} \frac{{t — \sqrt {3t + 4}}}}{{4 — t}}\]

Показать решение

Этот предел требует немного больше работы, чем два предыдущих. Однако еще раз обратите внимание, что мы получаем неопределенную форму 0/0, если пытаемся просто оценить предел. Также обратите внимание, что ни один из двух примеров здесь не поможет, по крайней мере, на начальном этапе. Мы не можем разложить уравнение на множители и не можем просто что-то умножить, чтобы упростить уравнение. 92}\]

Итак, если в первом и/или втором члене есть квадратный корень, рационализация устранит корень(и). Этот может помочь в оценке предела.

Попробуем рационализировать числитель в этом случае.

\[\ mathop {\lim }\limits_{t \to 4} \frac{{t — \sqrt {3t + 4}}}}{{4 — t}} = \mathop {\lim }\limits_{t \ до 4} \frac{{\left( {t — \ sqrt {3t + 4}} \right)}}{{\left( {4 — t} \right)}}\,\frac{{\left( {t + \sqrt {3t + 4}} \right)}}{{\left( {t + \sqrt {3t + 4}} \right)}}\] 92} — 3t — 4}}{{\left( {4 — t} \right)\left( {t + \sqrt {3t + 4} } \right)}}\end{align*}\]

Обратите внимание, что мы также не умножали знаменатель. Большинство студентов заканчивают занятия по алгебре с вбитой в голову мыслью всегда умножать этот материал. Однако в этом случае умножение сделает задачу очень сложной, и в конце концов вы все равно просто разложите ее на множители.

На этом этапе мы почти закончили. Обратите внимание, что мы можем разложить числитель на множители, так что давайте сделаем это.

\[\ mathop {\lim }\limits_{t \to 4} \frac{{t — \sqrt {3t + 4}}}}{{4 — t}} = \mathop {\lim }\limits_{t \ до 4} \frac{{\left( {t — 4} \right)\left( {t + 1} \right)}}{{\left( {4 — t} \right)\left( {t + \sqrt {3t + 4} } \справа)}}\]

Теперь все, что нам нужно сделать, это заметить, что если мы вычитаем «-1» из первого члена в знаменателе, мы можем сделать некоторое сокращение. В этот момент проблема деления на ноль исчезнет, ​​и мы сможем оценить предел.

\[\begin{align*}\mathop {\lim}\limits_{t \to 4} \frac{{t — \sqrt {3t + 4}}}}{{4 — t}} & = \mathop {\ lim }\limits_{t \to 4} \frac{{\left( {t — 4} \right)\left( {t + 1} \right)}}{{ — \left( {t — 4} \ right)\left( {t + \sqrt {3t + 4} } \right)}}\\ & = \mathop {\lim }\limits_{t \to 4} \frac{{t + 1}}{{ — \left( {t + \sqrt {3t + 4} } \right)}}\\ & = — \frac{5}{8}\end{align*}\]

Заметим, что если бы мы умножили знаменатель, мы бы не смогли сделать это сокращение и, по всей вероятности, даже не увидели бы, что какое-то сокращение можно было бы сделать. 92} + 5 & \hspace{0.25in}{\mbox{if }}y < - 2\\ 1 - 3y & \hspace{0.25in}{\mbox{if }}y \ge - 2\end{align *} \Правильно.\]

Вычислите следующие пределы.

1. \(\ mathop {\lim }\limits_{y \to 6} g\left( y \right)\)
2. \(\ mathop {\lim }\limits_{y \to — 2} g\left( y \right)\)

Показать все решения Скрыть все решения

a \(\mathop {\lim }\limits_{y \to 6} g\left( y \right)\) Показать решение

В этом случае делать особо нечего. При выполнении ограничений помните, что мы всегда должны смотреть на то, что происходит по обе стороны от рассматриваемой точки, когда мы приближаемся к ней. В этом случае \(y = 6\) полностью находится внутри второго интервала функции, поэтому по обе стороны от \(y = 6\) есть значения \(y\), которые также находятся внутри этого интервала. Это означает, что мы можем просто использовать этот факт для оценки этого предела.

\[\begin{align*}\mathop {\lim}\limits_{y \to 6} g\left(y\right) & = \mathop {\lim}\limits_{y \to 6}( 1 — 3y )\\ & = — 17\end{align*}\]

b \(\mathop {\lim }\limits_{y \to — 2} g\left( y \right)\) Показать решение

Эта часть является реальной причиной этой проблемы. В этом случае точка, для которой мы хотим взять предел, является точкой отсечки для двух интервалов. Другими словами, мы не можем просто подставить \(y = — 2\) во вторую часть, потому что этот интервал не содержит значений \(y\) слева от \(y = — 2\) и нам нужно знать, что происходит по обе стороны точки.

Чтобы выполнить эту часть, нам нужно вспомнить факт из раздела об односторонних пределах, в котором говорится, что если два односторонних предела существуют и одинаковы, то нормальный предел также будет существовать и иметь то же значение.

Обратите внимание, что оба односторонних ограничения могут быть выполнены здесь, так как мы будем смотреть только на одну сторону рассматриваемой точки. 2} + 5 & \hspace{0.25in}{\mbox{if}}y < - 2\\ 3 - 3y & \hspace{0.25in}{ \mbox{if }}y \ge - 2\end{align*} \right.\] 9+ }{\mbox{ подразумевает }}y > — 2\\ & = 9\end{align*}\]

Односторонние пределы одинаковы, поэтому мы получаем

\[\ mathop {\lim}\limits_{y \to — 2} g\left( y \right) = 9\]

Есть еще один предел, который нам нужно сделать. Однако нам понадобится новый факт о пределах, который поможет нам в этом.

Факт

Если \(f\left( x \right) \le g\left( x \right)\) для всех \(x\) на \([a, b]\) (за исключением, возможно, \ (x = c\)) и \(a \le c \le b\), тогда

\[\ mathop {\lim }\limits_{x \to c} f\left( x \right) \le \ mathop {\lim }\limits_{x \to c} g\left(x \right)\]

Обратите внимание, что этот факт должен иметь для вас некоторый смысл, если мы предположим, что обе функции достаточно хороши. Если обе функции «достаточно хороши», чтобы использовать факт вычисления предела, то мы имеем

. \[\ mathop {\lim}\limits_{x \to c} f\left(x\right) = f\left(c\right) \le g\left(c\right) = \mathop {\lim} \limits_{x \to c} g\left( x \right)\]

Неравенство верно, потому что мы знаем, что \(c\) находится где-то между \(a\) и \(b\), и в этом диапазоне мы также знаем \(f\left( x \right) \le g\ влево( х \вправо)\).

Обратите внимание, что на самом деле нам не нужно, чтобы две функции были достаточно хорошими, чтобы факт был правдой, но он обеспечивает хороший способ дать быстрое «обоснование» факту.

Также обратите внимание, что мы сказали, что предполагали, что \(f\left( x \right) \le g\left( x \right)\) для всех \(x\) на \([a, b]\ ) (за исключением, возможно, точки \(x = c\)). Поскольку пределы не заботятся о том, что на самом деле происходит в \(x = c\), нам на самом деле не нужно, чтобы неравенство выполнялось в этой конкретной точке. Нам нужно только, чтобы он держался вокруг \(x = c\), так как это то, о чем заботится предел.

Мы можем развить этот факт еще на один шаг, чтобы получить следующую теорему.

Теорема сжатия

Предположим, что для всех \(x\) на \([a, b]\) (кроме, возможно, на \(x = c\)) имеем

\[f\влево( x \вправо) \le h\влево( x \вправо) \le g\влево( x \вправо)\]

Также предположим, что

\[\ mathop {\ lim} \ limit_ {x \ to c} f \ left ( x \ right) = \ mathop {\ lim } \ limits_ {x \ to c} g \ left ( x \ right) = L \ ]

для некоторых \(a \le c \le b\). Затем

\[\ mathop {\lim}\limits_{x \to c} h\left( x \right) = L\]

Как и в случае с предыдущим фактом, нам нужно только знать, что \(f\left( x \right) \le h\left( x \right) \le g\left( x \right)\) верно вокруг \( x = c\), потому что мы работаем с ограничениями, а они касаются только того, что происходит вокруг \(x = c\), а не того, что на самом деле происходит в \(x = c\).

Теперь, если мы снова предположим, что все три функции достаточно хороши (опять же, это не требуется, чтобы сделать теорему о сжатии верной, это только помогает с визуализацией), тогда мы можем получить быстрый набросок того, что говорит теорема о сжатии. нас. На следующем рисунке показано, что происходит в этой теореме.

Из рисунка видно, что если пределы \(f(x)\) и \(g(x)\) равны в \(x = c\), то значения функции также должны быть равны в \ (x = c\) (здесь мы используем тот факт, что мы предполагали, что функции «достаточно хороши», что на самом деле не требуется для теоремы). Однако, поскольку \(h(x)\) «зажато» между \(f(x)\) и \(g(x)\) в этой точке, то \(h(x)\) должно иметь то же значение . Следовательно, предел \(h(x)\) в этой точке также должен быть таким же.

Теорема сжатия также известна как 92} \ cos \ влево ( {\ гидроразрыва {1} {х}} \ вправо) \]

Показать решение

В этом примере ни один из предыдущих примеров нам не поможет. Здесь нет факторинга или упрощения. Мы не можем рационализировать, и односторонние ограничения не сработают. Возникает даже вопрос, будет ли существовать этот предел, поскольку у нас есть деление на ноль внутри косинуса при \(x=0\).

Стационарный АБЗ Ca-Long CL-1500 в Москве

Анализы в KDL. Натрий, калий, хлор (Na/K/Cl)

Натрий, калий и хлор – это минеральные вещества, способные проводить электрический заряд. Они называются электролитами и делятся на катионы (носители положительного заряда) и анионы (носители отрицательного заряда). К катионам относятся калий и натрий, к анионам – хлор и его соединения. В организме электролиты содержатся в виде растворов солей в тканях и межклеточной жидкости. Некоторое их количество циркулирует в крови. Эти вещества способствуют обменным процессам организма, играют роль в поддержании водного баланса и уровня pH (кислотно-щелочной баланс).

Калий жизненно важен для клеточного метаболизма — он помогает транспортировать питательные вещества внутрь клетки и выводить из нее отходы, передает нервно-мышечные импульсы и участвует в работе сердечной мышцы. Он присутствует во всех жидкостях организма, но большая часть калия находится в клетках. Лишь небольшое его количество присутствует в крови.

Обычно калий поступает с пищей в достаточном количестве и выводится почками. Уровень калия жестко регулируется организмом при помощи гормона альдостерона, поскольку даже незначительные колебания содержания калия могут иметь значительные последствия для здоровья – такие, как шок, дыхательная и сердечная недостаточность, аритмия и остановка сердца. При электролитном дисбалансе возникает смещение pH организма в кислую (ацидоз) или щелочную (алкалоз) сторону, что приводит к угрожающим для жизни последствиям и требует незамедлительного лечения.

Натрий в основном содержится в жидкостях организма, и обеспечивает такие функции, как поддержание внеклеточного осмотического давления, проведение нервно-мышечных импульсов и участие в клеточном обмене. Значительное количество натрия циркулирует в крови. Как и калий, он поступает в организм с пищей из большинства продуктов, а также из поваренной соли. Организм регулирует уровень натрия в определенном диапазоне, а излишки выводит с помощью почек. Гормоны, такие как альдостерон и натрийуретический пептид, могут замедлить или ускорить выведение натрия с мочой.

Избыток уровня натрия, в том числе в результате его чрезмерного потребления (злоупотребление солью и солеными продуктами) приводит к повышению артериального давления, обезвоживанию, повышенной нагрузке на почки, сухости глаз и кожных покровов. При недостатке натрия вода задерживается в организме за счет действия гормона вазопрессина, что приводит к отекам, в особенности нижних конечностей, застойным явлениям и сердечной недостаточности.

Хлор — отрицательно заряженный ион, который совместно с калием и натрием помогает регулировать количество жидкости в организме и поддерживать кислотно-щелочной баланс. Он присутствует во всех жидкостях организма, но больше всего хлора содержится в крови и внеклеточной жидкости. Обычно концентрация хлора отражает уровень натрия и изменяется прямо пропорционально его изменениям. Однако при нарушениях pH уровень хлоридов в крови может изменяться независимо от уровня натрия, поскольку хлор действует как буфер. Таким образом он помогает поддерживать нейтральный pH в клетках, перемещаясь внутрь клеток или наружу по необходимости. Хлор поступает в организм с пищей и поваренной солью, его избыток выводится с мочой.

В каких случаях обычно назначают исследование?

• Как часть биохимического комплекса общего медицинского обследования;
• При диагностике дисбаланса pH (ацидоз, алкалоз) и для контроля эффективности его лечения;
• При таких жалобах, как аритмия, слабость, тошнота, отеки, помутнение сознания;
• Для контроля за эффективностью лечения заболеваний печени, почек, сердечной недостаточности;
• При обследовании пациентов с острыми и хроническими заболеваниями.

Что именно определяется в процессе анализа?

Происходит измерение концентрации электролитов в образце сыворотки крови пациента с помощью ионселективного метода.

Что означают результаты теста?

Концентрация электролитов в крови зависит от их поступления с пищей, содержания воды в организме и работы почек. Кроме того, влияние оказывают гормоны, такие как альдостерон (усиливает выведение калия и поддерживает уровень натрия) и натрийуретический пептид (ускоряет выведение натрия с мочой).

При нарушениях работы почек организм удерживает воду для разбавления натрия и хлора, что приводит к падению их концентрации ниже нормы. При обезвоживании концентрация электролитов наоборот может возрастать. Влияют на уровень калия, натрия и хлора сердечно-сосудистые и мышечные заболевания, сахарный диабет и патологии нервной системы.

Любые отклонения уровня электролитов от нормы, особенно калия, очень опасны для жизни и здоровья пациента, и могут быстро привести к серьезным нарушениям в работе сердца и даже к смерти. Поэтому в случае выявления отклонений необходимо как можно быстрее госпитализировать и обследовать пациента.

Сроки выполнения теста.

Обычно результат анализа можно получить на следующий день после взятия крови.

Как подготовиться к анализу?

Следует придерживаться общих правил подготовки к взятию крови из вены. С подробной информацией можно ознакомиться в соответствующем разделе статьи.

Кальций (Са2+), Натрий (Na+), Калий (К+), Хлор (Cl-)

Метод исследования

• Ионообменная хроматография

В организме присутствует большое число химических элементов, среди которых особое место занимают электролиты. Они присутствуют в тканях и внеклеточных жидкостях в виде свободных ионов (катионов и анионов). Ионы определяют постоянство ионного состава биологической среды организма.

Кальций (Ca²⁺). В сыворотке крови 50% кальция присутствует в свободной (ионизированной) форме (Са²⁺), 40% кальция циркулирует в комплексе с белками, 9% в виде солей. Именно свободный кальций является регулятором внутриклеточных процессов, измерение уровня ионизированного кальция параллельно с определением уровня общего кальция дает более полную диагностическую информацию.

Натрий (Na⁺) — основной катион внеклеточной жидкости. Изменение соотношения Na во внеклеточном и внутриклеточном пространстве определяет изменение осмотического давления, развитие отеков и обезвоживания. Натрий необходим для проведения нервных импульсов и образования костной ткани, обладает рядом регуляторных влияний. Баланс натрия зависит главным образом от нормальной функции почек, секреции альдостерона корой надпочечников, функционирования желудочно-кишечного тракта.

Калий (К⁺) — основной катион внутриклеточной жидкости, в крови содержится не более 2% от общего количества калия. Концентрация К в крови тесно связана с состоянием кровообращения и кислотно-щелочного равновесия. Наиболее частая причина гипокалиемии — повышенная потеря К почками. Гиперкалиемия может развиваться в случаях увеличения поступления или снижения выведения К, а также несоблюдения условий взятия крови.

Хлор (Cl^—) — основной анион внеклеточной жидкости, играет важную роль в поддержании кислотно-основного состояния, осмотического равновесия плазмы крови, лимфы, спинномозговой жидкости и некоторых тканей, баланса воды в организме, является компонентом желудочного сока. Ионы хлора формируют мембранный потенциал клеток, активизируют ряд ферментов. При потере хлоридов развивается алкалоз, при избыточном потреблении — ацидоз. Содержание хлора в организме зависит от баланса поступления хлора с пищей; распределения в тканях и жидкостях организма и выведения с мочой.

Показания к исследованию:

Кальций (Ca²⁺)

• Оценка содержания кальция в организме 
• Диагностика заболеваний желудочно-кишечного тракта
• Включая язвенные заболевания желудка и 12-перстной кишки 
• Диагностика заболеваний почек 
• Диагностика остеопороза 
• Диагностика злокачественных заболеваний

Натрий (Na⁺)

• Нарушение водно-электроитного баланса 
• Диагностика заболеваний почек

Хлор (Cl^—)

• Диагностика сердечно-сосудистых заболеванпий
• Диагностика заболеваний щитовидной железы
• Диагностика заболеваний почек и надпочечников.

Кальция хлорид инструкция по применению: показания, противопоказания, побочное действие – описание Calcium chloride р-р д/в/в введения 1 г/10 мл: амп. 10 шт. (8953)

E83.5 — Нарушения обмена кальция

E87.5 — Гиперкалиемия — список препаратов нозологической группы в справочнике МКБ-10

границ | Ca2 + -зависимость регулируемых по объему VRAC / LRRC8 и TMEM16A Cl– каналов

Введение

Набухание клеток активирует токи Cl ^— (I _{Cl , набухание} ), которые известны как регулируемые анионные каналы объема — (VRAC) (Jentsch, 2016; Pedersen et al., 2016; Strange et al., 2019). VRAC теперь идентифицируется как LRRC8 / SWELL1 (Qiu et al., 2014; Voss et al., 2014). Его гексамерная структура описана в четырех независимых крио-ЭМ исследованиях (Deneka et al., 2018; Kasuya et al., 2018; Kefauver et al., 2018; Kern et al., 2019). Существенная субъединица LRRC8A вместе с вариабельной комбинацией дополнительных четырех паралоговых белков LRRC8B-E образует гетеромеры с различными кинетическими свойствами. Многочисленные исследования показывают вклад этих каналов в устойчивость клеток к цисплатину и другим противораковым препаратам (Ise et al., 2005; Mahmud et al., 2008; Planells-Cases et al., 2015) и, возможно, к росту рака (Lemonnier et al. ., 2004; Kunzelmann et al., 2019; Liu, Stauber, 2019; Lu et al., 2019). Другие сообщили о роли VRAC в апоптотической гибели клеток (Gulbins et al., 2000; Okada et al., 2006; Wanitchakool et al., 2016). Несмотря на структурную информацию, механизм активации каналов VRAC / LRRC8 остается не совсем понятным. Хотя снижение внутриклеточной ионной силы является важным предварительным условием (Cannon et al., 1998; Sabirov et al., 2000; Syeda et al., 2016), внутриклеточный Ca ²⁺ оказался важным для активации I _Cl . _{, набухание} и для регулирования клеточного объема (Mccarty and O’neil, 1992; Lemonnier et al., 2002; Акита и др., 2011; Бенедетто и др., 2016; Лю и др., 2019).

Набухание клеток активирует не только VRAC / LRRC8, но и Ca ²⁺ -зависимый TMEM16A (Almaca et al., 2009; Benedetto et al., 2016; Liu et al., 2019) и каналы / скрамблазы TMEM16F (Juul et al. ., 2014; Сирианант и др., 2016а). Наши более ранние результаты показывают, что как TMEM16A, так и LRRC8 вносят вклад в I _{Cl , набухание} (Benedetto et al., 2016) в зависимости от Ca ²⁺ . Это было показано также для индуцированной сывороткой активации тока (Zhang et al., 2020). Фактически, мы продемонстрировали, что LRRC8 не важен для I _{Cl , набухания} или регуляции клеточного объема (Milenkovic et al., 2015; Sirianant et al., 2016b). В частности, в дифференцированных наивных клетках в тканях и в эпителиальных клетках с большой транспортной способностью физиологическое значение LRRC8 может быть ограничено (Almaca et al., 2009; Milenkovic et al., 2015; Sirianant et al., 2016b).

Предыдущие исследования не дали ответа на вопрос, активируются ли LRRC8 и TMEM16A / F параллельно, чтобы вызвать I _{Cl , набухание} , или же белки TMEM16, в частности TMEM16A, поддерживают активацию LRRC8, способствуя Ca ²⁺ сигналы вблизи плазматической мембраны (Benedetto et al., 2016; Cabrita et al., 2017). Для сравнения, такой Ca ²⁺ -модулирующий эффект TMEM16A является фундаментальным для активации CFTR, как было продемонстрировано in vitro и in vivo у мыши и человека (Von Kleist et al., 1975; Benedetto et al., 2017, 2019b; Park et al., 2020), которые эндогенно экспрессируют оба белка. Эти данные свидетельствуют о том, что TMEM16A поддерживает высвобождение Ca ²⁺ из эндоплазматического ретикулума (ER) и вызывает приток Ca ²⁺ , который активирует TMEM16A и поддерживает активацию LRRC8.

Материалы и методы

Культура клеток

Все клетки выращивали при 37 ° C в увлажненной атмосфере с 5% (об. / Об.) CO ₂ . Эмбриональные клетки почек человека HEK293T (Simmons, 1990), стабильно экспрессирующие йодид-чувствительный усиленный желтый флуоресцентный белок (eYFP-I152L; HEK-YFP; Amgen, Thousand Oaks, Калифорния, США), выращивали в среде с низким содержанием глюкозы DMEM с добавлением 10% (об. / об.) фетальная бычья сыворотка (FBS), 1% (об. / об.) L-глутамин 200 мМ и 10 мМ HEPES (все от Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Германия) в присутствии селективного антибиотика пуромицина 0.5 мкг / мл (Sigma-Aldrich, Миссури, США). Клетки, стабильно коэкспрессирующие TMEM16A (HEK-YFP-TMEM16A), культивировали с дополнительным гигромицином B (150 мкг / мл; Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Германия). Эпителиальные клетки карциномы толстой кишки человека HT29, стабильно экспрессирующие eYFP-I152L (HT29-YFP, любезно предоставленные профессором Луисом Галиеттой, TIGEM, Поццуоли, и профессором Николеттой Педемонте, Институт Джаннины Гаслини, Генуя, Италия), культивировали в среде Маккоя с добавками 5A. с 10% (об. / об.) FBS и селективным антибиотиком G418 1 мг / мл (все от Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Германия).

ОТ-ПЦР, миРНК и кДНК

Человеческих LRRC8A (NM_00127244.1) и LRRC8C (NM_032270.5) были субклонированы в бицистронный вектор pIRES2 (Clontech Laboratories / Takara Bio United States, Mountain View, California, United States) с использованием стандартных методов. Конструкция была проверена секвенированием (Microsynth Seqlab, Геттинген, Германия). Трансфекцию кДНК в клетки HEK293T проводили с использованием стандартных протоколов для Lipofectamine 3000 (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США).КДНК CD8 котрансфицировали, чтобы сделать возможным обнаружение сверхэкспрессирующих клеток путем связывания гранул, меченных анти-CD8 (Dynabeads ^® M-450 Epoxy; Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США). Нокдаун TMEM16A и LRRC8A в клетках HT29 проводили посредством трансфекции путем электропорации siRNA siTMEM16A (5-GGUUCCCAG CCUACCUCACUAACUU-3, Invitrogen, Carlsbad, California, United States) и / или siLRRCAUCAUCAUCCI, , Техас, США), используя систему трансфекции неона (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США) с программой из трех импульсов, 1650 В и 10 мс.Скремблированную миРНК (Silencer ^® Select Negative Control siRNA # 1, Ambion, Austin, Texas, United States) трансфицировали в качестве отрицательного контроля. Все эксперименты проводили через 48–72 ч после трансфекции.

Вестерн-блоттинг

Белок был выделен из клеток с использованием лизирующего буфера, содержащего 25 мМ Трис-HCl pH 7,4, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 5% глицерин, 0,43% Nonidet P-40, 100 мМ дитиотреитол (оба от PanReac AppliChem, Барселона, Испания). ) и смесью 1х ингибиторов протеаз (Roche, Базель, Швейцария).Затем белки разделяли с помощью 8,5% SDS-PAGE и переносили на PVDF-мембрану (GE Healthcare, Мюнхен, Германия). Мембраны инкубировали с первичными кроличьими моноклональными антителами против TMEM16A / DOG1 (# NBP1-49799; Novus Biologicals, Литтлтон, Колорадо, США; 1: 500 в 1% (мас. / Об.) NFM / TBS-T) или кроличьими поликлональными антителами. -LRRC8A-антитело (# HPA016811; Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США; 1: 1000 в 1% (мас. / Об.) BSA / TBS-T) в течение 2,5 ч при комнатной температуре. Кроличьи поликлональные антитела против β-актина (A2066; Sigma-Aldrich, St.Луис, штат Миссури, США; 1: 10000 в 5% (мас. / Об.) NFM / TBS-T) использовали для контроля загрузки. Затем мембраны инкубировали с конъюгированными с пероксидазой хрена (HRP) козьими поликлональными вторичными антителами против кроликов (# 31460; Invitrogen, Carlsbad, California, United States) при комнатной температуре в течение 2 часов, и иммунореактивные сигналы визуализировали с использованием набора для обнаружения хемилюминесцентных субстратов SuperSignal. (# 34577; Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США).

Зажимной патч

Клетки фиксировали пластырем на покровных стеклах.Если не указано иное, патч-пипетки заполняли цитозольным раствором, содержащим (мМ) KCl 30, K-глюконат 95, Nah3PO4 1,2, Na2HPO4 4,8, EGTA 1, Ca-глюконат 0,758, MgCl2 1,03, D-глюкозу 5, АТФ. 3; 290 мосм / л; pH 7,2. Концентрация свободного Ca ²⁺ (активность Ca ²⁺ ) составляла 0,1 мкМ. Чтобы довести концентрацию Ca ²⁺ в пипетке до 0,01 мкМ, раствор для заполнения пипетки содержал (мМ) KCl 30, K-глюконат 95, Nah3PO4 1,2, Na2HPO4 4,8, EGTA 1, Ca-глюконат 0,209, MgCl2 1.03, D-глюкоза 5 и АТФ 3; 290 мосм / л; pH 7,2. Концентрации свободного Ca ²⁺ рассчитывались по программе, разработанной в Институте биофизики им. Макса Планка (Франкфурт, Германия). Активности Ca ²⁺ (концентрации свободного Ca ²⁺ ) были первоначально подтверждены потенциометрическим определением с использованием Ca ²⁺ -чувствительных электродов. В некоторых экспериментах патч-пипетки заполняли буфером CsCl, содержащим (мМ) CsCl 125, Nah3PO4 1,2, Na2HPO4 4,8, EGTA 1, Ca-глюконат 0.209, MgCl2 1,03, D-глюкоза 5 и АТФ 3; pH 7,2. В этих экспериментах в качестве раствора для ванны использовали буфер CsCl, содержащий 145 CsCl, 0,4 Kh3PO4, 1,6 K2HPO, 4,6 D-глюкозы, 1 MgCl2 и 1,3 Ca ²⁺ глюконат, 290 мосм / л; pH 7,4.

Покровные стекла помещали в камеру перфузируемой ванны на предметном столике инвертированного микроскопа (IM35, Zeiss) и хранили при 37 ° C. Баню непрерывно перфузировали раствором Рингера со скоростью 8 мл / мин. Для активации зависящих от объема токов Cl ^— используйте изотонический раствор ванны Рингера (300 мосм / л; мМ: 145 NaCl, 0.4 Kh3PO4, 1,6 K2HPO, 4,6 D-глюкозы, 1 MgCl2, 1,3 Ca ²⁺ глюконат, pH 7,4) заменяли на раствор гипотонической ванны (Hypo; 200 мосм / л) путем удаления 50 мМ NaCl из раствора Рингера. Эксперименты «патч-зажим» проводили в быстрой цельноклеточной конфигурации. Пипетки-патчи имели входное сопротивление 4–6 МОм при заполнении цитозольным (физиологическим) раствором. Токи были скорректированы на последовательное сопротивление. Проводимость доступа измерялась непрерывно и составляла 60–140 нСм. Токи (токовые клещи) и напряжения (токовые клещи) регистрировались с помощью усилителя с коммутационным зажимом (EPC 7, List Medical Electronics, Дармштадт, Германия), интерфейса LIh2600 и программного обеспечения PULSE (HEKA, Lambrecht, Германия), а также Chart программное обеспечение (AD Instruments, Spechbach, Германия).Данные непрерывно сохранялись на жестком диске компьютера и анализировались с помощью программного обеспечения PULSE. Через равные промежутки времени напряжение мембраны (Vc) было ограничено с шагом 20 мВ от -100 до +100 мВ от удерживающего напряжения -100 мВ. Плотность тока рассчитывалась делением токов всей ячейки на емкость ячейки.

Закалка YFP

Тушение внутриклеточной флуоресценции, генерируемой стабильной трансфекцией чувствительного к йодиду (I ^— ) усиленного желтого флуоресцентного белка (eYFP-I152L), использовали для измерения анионной проводимости.Флуоресценцию YFP возбуждали на длине волны 490 нм с использованием высокоскоростной полихроматической системы освещения для микроскопических измерений флуоресценции (Visitron Systems, Пуххайм, Германия), а испускаемый свет на длине волны 535 ± 25 нм регистрировали с помощью CCD-камеры CoolSnap HQ (Roper Scientific, Planegg). , Германия / Visitron Systems, Пуххайм, Германия). Клетки выращивали на покровных стеклах и помещали в камеру для получения изображений с термостатическим контролем, адаптированную к инвертированному микроскопу (Axiovert S100, Zeiss, Oberkochen, Германия), поддерживали при 37 ° C и перфузировали со скоростью 5 мл / мин.После короткого периода в стандартном растворе Рингера (в мМ: NaCl 145, KH ₂ PO ₄ 0,4, K ₂ HPO ₄ ⋅ 3 H ₂ 0 1,6, глюкоза 5, MgCl ₂ ⋅ 6 H ₂ 0 1, Ca-глюконат ⋅ 1 H ₂ 0 1,3), клетки стимулировали гипотоническим (200 мосм / л) раствором следующего состава (в мМ): NaCl 45, KH ₂ PO ₄ 0,4, K ₂ HPO ₄ 3 H ₂ 0 1,6, глюкоза 5, MgCl ₂ ⋅ 6 H ₂ 0 1, Ca-глюконат ⋅ 1 H ₂ 0 1.3, Na-глюконат 50) или изотонический раствор в качестве контроля (в мМ: NaCl 45, KH ₂ PO ₄ 0,4, K ₂ HPO ₄ ⋅ 3 H ₂ 0 1,6, глюкоза 5, MgCl ₂ 6 H ₂ 0 1, Ca-глюконат ⋅ 1 H ₂ 0 1,3, Na-глюконат 50, маннитол 100). Тушение флуоресценции YFP за счет притока I ^— было вызвано заменой 50 мМ внеклеточного глюконата на I ^— . Управление экспериментом, получение изображений и анализ данных выполнялись с помощью программного пакета MetaFluor (Universal Imaging, Bedford Hills, Нью-Йорк, США).Автофлуоресценция была незначительной. Для количественного анализа отбрасывали клетки с низкой или чрезмерно высокой флуоресценцией. Изменения флуоресценции, вызванные захватом I ^—, выражаются как начальные скорости максимального уменьшения флуоресценции (а.е. / с).

В качестве альтернативы измерения гашения YFP проводили на флюоресцентном микропланшет-ридере (NOVOstar, BMG Labtech, Ортенберг, Германия), поддерживаемом при 37 ° C, с использованием длины волны возбуждения 485 нм и детектирования излучения при 520 нм. Клетки помещали в прозрачные 96-луночные планшеты (Sarstedt, Nümbrecht, Германия), культивировали 48–72 ч до 80–90% конфлюэнтности и инкубировали с тестируемыми соединениями или без них в стандартном растворе Рингера (300 мосм / л).После короткого считывания базальной флуоресценции клетки стимулировали гипотоническим (200 мосм / л) раствором (в мМ: NaCl 21,67, NaI 26,67, KH ₂ PO ₄ 0,4, K ₂ HPO ₄ ⋅ 3 H ₂ 0 1,6, глюкоза 5, MgCl ₂ ⋅ 6 H ₂ 0 1, Ca-глюконат ⋅ 1 H ₂ 0 1,3, маннитол 58) добавляется путем автоматической инъекции через шприцевой насос или изотонический раствор (в мМ: NaCl 21,67, NaI 26,67, KH ₂ PO ₄ 0,4, K ₂ HPO ₄ ⋅ 3 H ₂ 0 1.6, глюкоза 5, MgCl ₂ 6 H ₂ 0 1, Ca-глюконат ⋅ 1 H ₂ 0 1,3, маннитол 193,3) в качестве контроля. Для стимуляции АТФ клетки инкубировали с тестируемыми соединениями или без них в глюконат-замещенном растворе Рингера (в мМ: NaCl 100, Na-глюконат 40, KCl 5, MgCl ₂ ⋅ 6 H ₂ 0 1, CaCl ₂ ⋅ 2 H ₂ 0 2, глюкоза 10, HEPES 10) и АТФ добавляли в симметричный I ^— -замещенный раствор Рингера (в мМ: NaCl 100, NaI 40, KCl 5, MgCl ₂ ⋅ 6 H ₂ 0 1, CaCl ₂ ⋅ 2 H ₂ 0 2, D-глюкоза 10, HEPES 10).Конечная концентрация I ^— в каждой лунке составляла 20 мМ для каждого эксперимента. Интенсивность общей внутриклеточной YFP-флуоресценции в каждой лунке измеряли непрерывно. Фоновую флуоресценцию вычитали, и данные нормализовали по исходной флуоресценции. Затем рассчитывали начальную скорость максимального затухания флуоресценции, вызванного притоком I ^— , как меру анионной проводимости.

Ca

Клетки высевали на покровные стекла и загружали 2 мкМ Fura-2, AM Ester (Biotium, Hayward, California, United States) и 0.02% Pluronic F-127 (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США) в стандартном растворе Рингера (в мМ: NaCl 145, KH ₂ PO ₄ 0,4, K ₂ HPO ₄ 3 H ₂ 0 1,6, глюкоза 5, MgCl ₂ 6 H ₂ 0 1, Ca-глюконат ⋅ 1 H ₂ 0 1,3) в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем клетки помещали в термостатируемую камеру для визуализации, адаптированную к инвертированному микроскопу (Axiovert S100, Zeiss, Оберкохен, Германия), поддерживали при 37 ° C и перфузировали со скоростью 5 мл.Fura-2 возбуждали на длине волны 340/380 нм с использованием высокоскоростной полихроматической системы освещения для микроскопических измерений флуоресценции (Visitron Systems, Пуххайм, Германия), а излучение регистрировали между 470 и 550 нм с помощью камеры CoolSnap HQ CCD (Roper Scientific, Планегг, Германия / Visitron Systems, Пуххайм, Германия). Клетки стимулировали АТФ или гипотоническим (200 мосм / л) раствором (в мМ: NaCl 95, KH ₂ PO ₄ 0,4, K ₂ HPO ₄ 3 H ₂ 0 1.6, глюкоза 5, MgCl ₂ 6 H ₂ 0 1, Ca-глюконат ⋅ 1 H ₂ 0 1,3). Внутриклеточный кальций ([Ca ²⁺ ] _i ) рассчитывали из отношения флуоресценции 340/380 нм после вычитания фона по формуле [Ca ²⁺ ] _i = Kd × (R− R _min ) / (R _max −R) × (S _f2 / S _b2 ) , где R — наблюдаемый коэффициент флуоресценции.Значения R _max и R _min (максимальное и минимальное соотношения) и константа S _f2 / S _b2 (флуоресценция свободных и Ca ²⁺ -связанный Fura-2 при 380 нм) рассчитывали с использованием 2 мкМ иономицина (Calbiochem, Сан-Диего, Калифорния, США), 5 мкМ нигерицина (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США), 10 мкМ моненсин (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) и 5 ​​мМ EGTA (Carl Roth, Карлсруэ, Германия) для уравновешивания внутриклеточного и внеклеточного Ca ²⁺ в интактных клетках, нагруженных Fura-2.Константа диссоциации ( Kd ) комплекса Fura-2⋅Ca ²⁺ была принята равной 224 нМ. Управление экспериментом, получение изображений и анализ данных выполнялись с помощью программного пакета MetaFluor (Universal Imaging, Bedford Hills, Нью-Йорк, США).

Материалы и статистический анализ

Suramin, U73122, 2-APB, дантролен и NS3728 были из Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США. Никлозамид, Ani9 и DCPIB были из Токриса, Бристоль, Соединенное Королевство.Ксестоспонгин С и никлозамидэтаноламин были от Cayman Chemical, Ann Arbor, Michigan, United States. Пробенецид был от MP Biomedicals, Ирвин, Калифорния, США. Данные представлены в виде отдельных кривых или сводок со средними значениями ± SEM и количеством экспериментов, указанными в легенде каждого рисунка. Для статистического анализа использовали парный или непарный критерий Стьюдента t соответственно. Значение p <0,05 было принято как статистически значимое различие (обозначено # для непарных данных и ^* для парных данных).

Результаты

Активация эндогенного и сверхэкспрессированного VRAC Ca

Более ранние исследования предполагали потребность в Ca ²⁺ для активации I _{Cl , набухания} и стимуляции эндогенного LRRC8 / Swell1 (Akita and Okada, 2011; Benedetto et al., 2016). Здесь мы непосредственно подтвердили зависимость Ca ²⁺ токов LRRC8 путем совместной экспрессии LRRC8A и LRRC8C в клетках HEK293 с использованием бицистронной экспрессионной плазмиды.На фигуре 1A показано сильное увеличение экспрессии LRRC8A по сравнению с эндогенной экспрессией LRRC8A (сверхэкспрессия LRRC8C не показана). Сверхэкспрессия LRRC8A / C в значительной степени увеличивала токи целых клеток, активируемых гипотоническим (200 мосм / л) раствором ванны (Hypo) в присутствии внутриклеточной (пипетка, 290 мосм / л) концентрации 100 нМ Ca ²⁺ . Сверхэкспрессия LRRC8A / C очень быстро активируется гипоиндуцированным набуханием клеток (рис. 1В). Постепенное снижение внутриклеточных (например, патч-пипетка) концентраций Ca ²⁺ до 10 и до 0 нМ постепенно подавляло гипоактивацию эндогенного I _{Cl , набухание} , а также сверхэкспрессированные токи LRRC8A / C (рисунки 1С, Г).Эксперименты указывают на потребность в Ca ²⁺ для активации VRAC / LRRC8.

Рисунок 1. Активация LRRC8A / C зависит от Ca ²⁺ . (A) Коэкспрессия LRRC8A и LRRC8C бицистронным вектором. Обнаружение LRRC8A вестерн-блоттингом. (B) Непрерывная регистрация токов целых клеток, активируемых гипотоническим набуханием клеток (Hypo, 200 мосм / л). Пипетка-патч [Ca ²⁺ ] составляла 100 нМ; внеклеточный Рингер [Ca ²⁺ ] был 1.3 мМ. (C) Наложение тока на всю ячейку, полученное с 100, 10 или 0 нМ Ca ²⁺ в растворе для заполнения патч-пипеток. Напряжение на зажимах варьировалось от -100 до +100 мВ с шагом 20 мВ. (D) Резюме гипоиндуцированных плотностей тока целых клеток (Vc = +100 мВ), полученных в ложно-трансфицированных и LRRC8A / C-экспрессирующих клетках HEK293 ( p <0,001 и <0,01, соответственно). Среднее ± SEM; n = 5–9 для каждой серии). ^# Значительное увеличение по сравнению с макетом (непарные т -тесты).Блоты выполняли в виде повторов.

TMEM16A поддерживает активацию I

Сообщалось, что TMEM16A (и TMEM16F) принимают участие в токе целых клеток, активируемом посредством набухания гипотонических клеток (I _{Cl , набухание} ), хотя не известно, что эти белки напрямую активируются при набухании клеток (Almaca et al. al., 2009; Benedetto et al., 2016; Sirianant et al., 2016a; Liu et al., 2019).Здесь мы исследовали влияние TMEM16A на активацию VRAC при различных внутриклеточных концентрациях Ca ²⁺ . При концентрации внутриклеточного покоя Ca ²⁺ , равной 100 нМ, эндогенный VRAC (фиктивный) и сверхэкспрессированный LRRC8A / C легко активируются осмотическим набуханием клеток (200 мосм / л; гипо). Однако активация была нарушена при 10 нМ внутриклеточного Ca ²⁺ ([Ca ²⁺ ] _i ) (рис. 2A). Даже при низком (10 нМ) [Ca ²⁺ ] _i сверхэкспрессия TMEM16A увеличивала гипотоническую активацию эндогенного VRAC и сверхэкспрессировала LRRC8A / C (Фигуры 2A, B).Это может указывать на то, что приток Ca ²⁺ также важен для активации VRAC, как предполагалось ранее (Sirianant et al., 2016a).

Рисунок 2. TMEM16A активируется Hypo и увеличивает I _{Cl , набухание} . (A) Продолжает регистрацию токов целых клеток, активированных в клетках HEK293 за счет гипотонического набухания клеток (Hypo, 200 мосм / л). (B) Соотношение между током и напряжением гипоактивированных токов цельной клетки. TMEM16A активируется Hypo и дополнительно увеличивает I _{Cl , набухает} в клетках, коэкспрессирующих TMEM16A и LRRC8A / C.Среднее ± SEM; n = 8–11 для каждой серии). ^# Значительное увеличение по сравнению с имитацией ( p <0,05–0,0001; непарные т -тесты).

Мы намеревались провести аналогичные эксперименты с избыточно экспрессированным TMEM16A при дозировке 100 нМ Ca ²⁺ , чтобы изучить, как присутствие TMEM16A повлияет на объемную активацию VRAC. Однако мы обнаружили, что сверхэкспрессированный TMEM16A активен даже при этой базовой внутриклеточной концентрации Ca ²⁺ и без какого-либо дополнительного увеличения Ca ²⁺ за счет гормональной стимуляции или ионофоров Ca ²⁺ (Рисунок 3).В этих экспериментах мы использовали буфер CsCl в качестве раствора для заполнения пипеток (100 нМ Ca ²⁺ ; 290 мосм / л) и внеклеточный буфер CsCl (1,3 мМ Ca ²⁺ ; 300 мосм / л), чтобы исключить любые возможный вклад токов K ⁺ . В отличие от ложно-трансфицированных клеток, клетки, сверхэкспрессирующие TMEM16A, демонстрировали большой базальный входящий ток Cl ^— , который ингибировался удалением внеклеточного Cl ^— , вызывая сдвиг вправо обратного потенциала (Фигуры 3A, B).Было обнаружено, что только сверхэкспрессируемый, но не эндогенный TMEM16A, активен на базальных внутриклеточных уровнях [Ca ²⁺ ], что было подробно исследовано ранее (Sirianant et al., 2016a; Schreiber et al., 2018). Таким образом, было трудно оценить вклад сверхэкспрессированного TMEM16A в активацию набуханием VRAC в клетках HEK293 при [Ca ²⁺ ] _i в 100 нМ.

Рис. 3. TMEM16A сверхэкспрессируется в клетках HEK293 спонтанно активен. (A) Запись непрерывного тока ложно-трансфицированной и экспрессирующей TMEM16A клетки HEK293. В этих экспериментах раствор для наполнения пипетки и раствор для ванны содержали CsCl (см. Методы). Удаление Cl ^— из раствора внеклеточной ванны, за исключением 5 мМ (5Cl ^—), оказало очень небольшое влияние на ложно-трансфицированную клетку, но сильно деполяризовало экспрессирующую TMEM16A клетку. (B) Соответствующие кривые I / V указывают на небольшие токи и слабый эффект 5Cl ^— в ложно-трансфицированных клетках, тогда как токи были большими и сильно подавлялись при сдвиге реверсивного потенциала в клетках, сверхэкспрессирующих TMEM16A.

Сверхэкспрессия TMEM16A не была активна в базовых условиях с 10 нМ внутриклеточного Ca ²⁺ (рис. 2). Сверхэкспрессия TMEM16A вместе с LRRC8A / C дополнительно увеличивала I _{Cl , набухание} , но оставалось неясным, активируется ли сам TMEM16A во время набухания клеток (высвобождением хранилища Ca ²⁺ или притоком Ca ²⁺ ) или TMEM16A поддерживает активацию LRRC8A / C. Поэтому мы провели дополнительные эксперименты на клетках HT ₂₉ , которые эндогенно экспрессируют оба ионных канала.

TMEM16A поддерживает активацию I

Мы повторно исследовали роль TMEM16A в активации LRRC8 / VRAC в клетках HT ₂₉ , которые продуцируют большие эндогенные токи Cl ^— , активируемые Ca ²⁺ , и токи VRAC, активируемые набуханием (Centeio et al., 2020; Рисунок 4). Как показано на рисунках 1, 2, эти эксперименты проводились с цитозольным раствором для наполнения пипеток (290 мосм / л, Ca ²⁺ 100 нМ, pH 7.2; c.f. Методы). Баню перфузировали раствором Рингера (300 мосм / л; Ca ²⁺ 1,3 мМ, pH 7,4). Нокдаун siRNA эндогенного TMEM16A ослаблял гипоиндуцированные токи целых клеток и изменял не зависящие от времени I _{Cl , набухание} на типичные для VRAC зависящие от времени токи (Рисунки 4A – D). Примечательно, что блокатор TMEM16A, никлозамид (1 мкМ), значительно ингибировал I _{Cl , набухание} с 182 ± 22 до 78 ± 9,2 пА / пФ ( n = 5). Нокаут эндогенного LRRC8A сильно ослаблял I _{Cl , набухание} , в то время как дополнительный нокаут TMEM16A не приводил к дальнейшему ослаблению I _{Cl , набуханию} .Эти данные предполагают, что TMEM16A, экспрессируемый в клетках HT ₂₉ , поддерживает активацию LRRC8 / VRAC, вероятно, облегчая гипоиндуцированное высвобождение Ca ²⁺ из хранилищ ER Ca ²⁺ .

Рисунок 4. TMEM16A поддерживает активацию LRRC8. (A) Hypo (200 мосм / л) -индуцированные наложения тока целых клеток, полученные в клетках HT ₂₉ , обработанных скремблированной РНК (scrbld), siRNA для TMEM16A, LRRC8A или обоих. Концентрация свободного Ca ²⁺ в растворе для заполнения патч-пипетки составляла 100 нМ. (B) Соответствующие вольт-амперные зависимости. (C) Гипоиндуцированная плотность тока всей клетки (Vc = +100 мВ). (D) Зависящая от времени активация цельноклеточных токов под действием Hypo. Среднее ± SEM; n = 9–14 для каждой серии). ^# Значительное снижение по сравнению с макетом ( p <0,01 для всех; непарные t -тесты).

Рисунок 5. Гипотоничность активирует TMEM16A-зависимое повышение Ca ²⁺ . (A) Сводка плотностей тока, индуцированного гипо (200 мосм / л), ингибируемых DCPIB в клетках HT ₂₉ ( n = 9–15). Концентрация свободного Ca ²⁺ в растворе для заполнения патч-пипетки составляла 100 нМ. (B) Гипоиндуцированный ток целой клетки перекрывается в клетках HT ₂₉ , обработанных скремблированной РНК (scrbld), siRNA для TMEM16A или обоих TMEM16F. (C) Эффект 2-APB (50 мкМ; p <0,001) и дантролена (50 мкМ; p <0.001) от плотности гипоиндуцированных токов (Vc = +100 мВ) ( n = 9–11). (D) Индуцированный АТФ (100 мкМ) ток целой клетки перекрывается в отсутствие или в присутствии миРНК. (E) Соответствующие вольт-амперные зависимости ( n = 9–11). (F) Влияние 2-APB (50 мкМ; p <0,001) и дантролена (50 мкМ) на плотности тока, индуцированные АТФ (Vc = +100 мВ) ( n = 7–9). (G) Влияние TMEM16A-siRNA на АТФ-индуцированное увеличение Ca ²⁺ ( n = 21–45; p <0.000004 и p <0,01 соответственно). (H) Эффект TMEM16A-siRNA на гипоиндуцированное повышение Ca ²⁺ ( n = 21–55; p <0,003). Плато Ca ²⁺ было определено в конце плато. Среднее ± SEM; ^# значительное снижение (непарный т -тест).

Вклад TMEM16A в активацию набухания эндогенного VRAC был исследован на ложно-трансфицированных клетках HEK293 (-T16A) или клетках HEK293, сверхэкспрессирующих TMEM16A (+ T16A) при различной внеклеточной гипотоничности.VRAC активировался раствором внеклеточной ванны с различной гипотоничностью (275, 240, 200 и 150 мосм / л). Данные демонстрируют увеличение гипотонической активации VRAC за счет коэкспрессии TMEM16A, которое было более значительным при менее выраженной гипотонии (дополнительный рисунок S1). Эти эксперименты проводили при 10 нМ внутриклеточной концентрации Ca ²⁺ .

Вклад TMEM16A в I

Поскольку набухание клеток и регулирование объема происходят в условиях фиксации без напряжения, мы исследовали роль TMEM16A для активации I _{Cl , набухание} в экспериментах по тушению йодида с использованием галогенид-чувствительного желтого флуоресцентного белка (YFP).При применении раствора гипотонической ванны (200 мосм / л) ожидается немедленное увеличение флуоресценции YFP из-за быстрого поглощения воды через аквапорины, разбавления анионов и ослабления флуоресценции YFP, которое происходит в течение нескольких секунд (Benedetto et al. , 2016). За этим следует гашение, вызванное йодидом, поскольку каналы VRAC активируются, что позволяет проникать йодиду (рис. 6В). Анализ максимальной скорости гашения показал четкую активацию галогенидной проводимости гипо (рис. 6С).Нокдаун siRNA TMEM16A или LRRC8A (Фигуры 6A, D) показал результаты, аналогичные результатам экспериментов с патч-зажимом: нокдаун TMEM16A ослаблял гипоиндуцированное тушение, в то время как он не уменьшал дополнительно тушение, ингибируемое siLRRC8A (Фигуры 6E, F). Следует отметить, что в предыдущих исследованиях мы наблюдали обратную корреляцию между экспрессией TMEM16A и LRRC8A. Например, было обнаружено, что TMEM16A сильно активируется в клетках, в которых отсутствует экспрессия LRRC8A (Benedetto et al., 2016). Таким образом, неудивительно, что обнаружение LRRC8A менее эффективно подавляется при параллельном нокдауне TMEM16A (вестерн-блоттинг на фиг. 6A).

Рис. 6. Гипоиндуцированная анионная проницаемость, измеренная в условиях фиксации без напряжения. (A) нокдаун миРНК LRRC8A, обнаруженный с помощью вестерн-блоттинга. Эффективность нокдауна составила 72%. Нокдаун TMEM16A усиливал экспрессию LRRC8A, что соответствует Benedetto et al. (2016). (B) Резюме временной зависимости гашения YFP, вызванного 20 мМ йодида в присутствии изотонического раствора Рингера (Iso; 300 мосмоль / л) или Hypo (200 мосмоль / л). (C) Краткое изложение начальной скорости закалки (условные единицы / с) ( n = 4; p <0.006). (D) нокдаун миРНК TMEM16A, обнаруженный с помощью вестерн-блоттинга. (E) Краткое изложение временной зависимости гипоиндуцированного тушения YFP в отсутствие или в присутствии миРНК. (F) Сводка начальных скоростей закалки (условные единицы / с) ( n = 19). p <0,0005 (siTMEM16A), p <2 × 10 ^–11 (siLRRC8A), p <2 × 10 ^–11 (siLRRC8A / siTMEM16A). (G, H) Гипоиндуцированное тушение YFP ​​отсутствовало в присутствии 0 мМ внеклеточного йодида, но постепенно увеличивалось с 5 мМ ( n = 4; p <0.003), 20 мМ ( n = 4; p <0,0009) и 50 мМ ( n = 4; p <0,0005). Среднее ± SEM; ^# значительное увеличение или уменьшение соответственно (непарный т -тест). Блоты выполняли в виде повторов.

Гипотоничность активирует TMEM16A-зависимый Ca

При анализе мгновенных плотностей пикового тока блокатор VRAC DCPIB ингибировал I _{Cl , набухание} независимо от siRNA-TMEM16A, тогда как siRNA-LRRC8A сильно ингибировал мгновенные пиковые токи (рис. 5A).Однако нокдаун TMEM16A вызывал выраженную зависящую от времени инактивацию I _{Cl , набухание} , и то же самое наблюдалось для нокдауна TMEM16F (Sirianant et al., 2016a; Рисунок 5B). Примечательно, что TMEM16F, как сообщается, также проводит ионы Ca ²⁺ , помимо его способности скремблировать фосфолипиды (Yang et al., 2012). Таким образом, белки TMEM16 поддерживают активность I _{Cl , набухают} , возможно, за счет поддержки высвобождения ER Ca ²⁺ и активации притока Ca ²⁺ (Benedetto et al., 2016; Cabrita et al., 2017). Для дальнейшего выяснения вклада высвобождения хранилища Ca ²⁺ в активацию I _{Cl , набухание} , клетки набухали в присутствии IP3R-ингибитора 2-ABP или ингибитора RyR дантролена, которые оба ингибировали I _{Cl , вздутие} (рис. 5С). Активация CaCC в клетках HT ₂₉ пуринергическим лигандом АТФ полностью зависела от TMEM16A, как показано siRNA-TMEM16A, и нокдаун LRRC8A не ставил под угрозу активацию CaCC (Фигуры 5D, E).Это указывает на то, что одного повышения Ca ²⁺ недостаточно для активации VRAC / LRRC8A. В отличие от стимуляции I _{Cl , набухания} , активация CaCC ингибировалась только 2-ABP, но не дантроленом (фиг. 5F). Используя датчик Ca ²⁺ Fura-2, мы исследовали, как TMEM16A влияет на повышение Ca ²⁺ , вызванное АТФ и гипо (200 мосм / л). АТФ индуцировал типичный пик (высвобождение запаса ER-Ca ²⁺ ) и ответ на плато (приток Ca ²⁺ ; SOCE), которые подавлялись в отсутствие TMEM16A (Cabrita et al., 2017; Рисунок 5G). Гипоиндуцированное увеличение Ca ²⁺ было намного меньше, но также ингибировалось siRNA-TMEM16A (фиг. 5H). Взятые вместе, данные демонстрируют роль TMEM16A в увеличении Ca ²⁺ , вызванном набуханием, что важно для полной активации I _{Cl , набухание} .

В дополнительных экспериментах мы варьировали концентрацию йодида в растворе гипотонической ванны от 0 до 50 мМ (Рисунки 6G, H). Показано, что при 0 мМ йодида тушение не происходит, а происходит только набухание клеток, на что указывает увеличение флуоресценции.С увеличением концентрации йодида во внеклеточном буфере максимум тушения YFP больше не достигается, и скорость тушения YFP увеличивается. Данные указывают на очень быструю активацию VRAC, которая, вероятно, параллельна снижению внутриклеточной ионной силы (Syeda et al., 2016). Напротив, регуляторное уменьшение объема (RVD) занимает значительно больше времени, на что указывает задержка YFP — повторное гашение в присутствии 0 мМ йодида.

Мы исследовали зависящее от концентрации тушение с помощью АТФ и обнаружили выраженное ингибирование тушения с помощью siRNA-TMEM16A (Фигуры 7A, B).Примечательно, что при выраженной стимуляции насыщающими концентрациями АТФ (50, 100 мкМ) индуцированное АТФ тушение незначительно, но значительно ингибировалось siLRRC8A. Это предполагает вклад VRAC в индуцированную АТФ проницаемость для галогенидов. Мы исследовали эффекты ряда различных ингибиторов на активацию I _{Cl , набухать} , тестируя их индивидуально на клетках HT _{2 9} . Мы решили проанализировать эффекты различных ингибиторов в экспериментах по подавлению YFP с недиализованными клетками и в условиях зажима без напряжения (вместо зажима участка целой клетки), чтобы оставить нетронутой внутриклеточную сигнализацию Ca ²⁺ и избежать артефакты из-за ограничения напряжения.

Рисунок 7. Роль передачи сигналов Ca ²⁺ для гипо- и АТФ-индуцированной анионной проницаемости. (A) Зависящее от времени тушение YFP, вызванное различными концентрациями АТФ ( n = 3-5). (B) Зависимость от концентрации АТФ-индуцированного тушения (условные единицы / с) и эффекты нокдауна TMEM16A или LRRC8A ( n = 4). (C) Сводка по АТФ-индуцированному тушению в отсутствие (контроль) или в присутствии блокаторов IP3R ксестоспонгина C (10 мкМ; p <10 ^–19 ), сурамина (500 мкМ; p <10 ^–7 ) и пробенецид (1 мМ; p <2 × 10 ^–9 ) ( n = 4–5). (D) Сводная информация о гашении, индуцированном Hypo (200 мосм / л) в отсутствие (контроль) или в присутствии DCPIB (30 мкМ; p <0,02), Ani9 (10 мкМ), сурамина (500 мкМ; ). p <2 × 10 ^–7 ), U73122 (10 мкМ; p <0,01), 2-APB (50 мкМ; p <10 ^–17 ), дантролен (50 мкМ; p <0,02), пробенецид (1 мМ; p <0,03) и NS3728 (10 мкМ; p <0,03) ( n = 4–5). (E, F) Вклад притока Ca ²⁺ в гипоиндуцированное тушение исследовали путем воздействия на клетки гипотонического раствора в присутствии физиологического (1.3 мМ; n = 5) или низкая (1 мкМ; n = 4; p <0,02) внеклеточная концентрация Ca ²⁺ . Среднее ± SEM; ^# — значительное ингибирование (непарный t -тест).

Три различных ингибитора IP3R-опосредованного высвобождения ER Ca ²⁺ из хранилища, ксестоспонгин C, сурамин и пробенецид, блокировали АТФ-индуцированную активацию проницаемости для галогенидов (рис. 7C). Гипо (200 мосм / л) -индуцированное тушение блокировалось блокатором VRAC DCPIB, но не блокатором TMEM16A Ani9 (Seo et al., 2016), предполагая, что присутствие TMEM16A, но не его проводимость Cl ^—, поддерживает активацию I _{Cl , набухание} (рис. 7D). Удивительно, но ингибирующий эффект DCPIB на гипоиндуцированное тушение, т.е. активацию VRAC, был довольно слабым. Однако это, вероятно, объясняется сильной зависимостью от напряжения ингибирования VRAC DCPIB. Во время измерений YFP, DCPIB применялся в условиях фиксации без напряжения, то есть при собственном отрицательном мембранном напряжении ячеек HT ₂₉ , которое составляет около -40 мВ.В дополнительных экспериментах с фиксацией положения мы обнаружили действительно слабое ингибирование VRAC с помощью DCPIB при отрицательных напряжениях фиксации, но гораздо более выраженное ингибирование при деполяризованных напряжениях фиксации (дополнительный рисунок S2). Регулятор трансмембранной проводимости при муковисцидозе (CFTR), другой канал Cl ^—, экспрессируемый в клетках HT ₂₉ , вряд ли будет вносить вклад в I _{Cl , набухание} , как это сделал ингибитор CFTR CFTRinh272 (30 мкМ). не подавляют активацию VRAC (данные не показаны).

Ряд соединений, ингибирующих IP3R- и RyR-опосредованное высвобождение ER Ca ²⁺ -накопителей, таких как сурамин, U73122, пробенецид и дантролен, а также NS3728 (Helix et al., 2003), ингибировали активацию I _{Класс , набухание} . Было обнаружено, что клетки HT _{2 9} экспрессируют все три паралога рецептора IP3, а также рецептор рианодина RyR2, а также канал TRPV4, который является каналом притока Ca ²⁺ , который наиболее часто играет роль. в регулировании объемов (Pasantes-Morales, 2016; дополнительный рисунок S3).Вклад притока Ca ²⁺ в активацию VRAC был продемонстрирован путем воздействия на клетки гипотонического раствора в присутствии низкого (1 мкМ) внеклеточного Ca ²⁺ , который ослаблял активацию VRAC (рисунки 7E, F). . Взятые вместе, Ca ²⁺ не может быть предпосылкой для активации VRAC. Однако высвобождение запаса Ca ²⁺ и приток Ca ²⁺ способствуют его активации, что согласуется с более ранними наблюдениями (Akita et al., 2011; Sirianant et al., 2016a; Лю и др., 2019). TMEM16A способствует увеличению внутриклеточного компартментализированного Ca ²⁺ и, таким образом, поддерживает активацию VRAC. Наряду с активацией набухания VRAC, TMEM16A активируется за счет индуцированного набуханием повышения внутриклеточного Ca ²⁺ . Степень этой корегуляции I _{Cl , набухание} зависит от клетки и зависит от экспрессии белков TMEM16.

Обсуждение

Настоящее исследование исследует активацию I _{Cl , набухание} в двух разных клеточных линиях.Использовали клетки HEK293, потому что эти клетки не экспрессируют TMEM16A и экспрессируют только очень низкие уровни LRRC8A. Таким образом, клеточная линия была идеальной для изучения эффектов сверхэкспрессии TMEM16A и LRRC8A / C. Напротив, клетки HT ₂₉ экспрессируют как TMEM16A, так и LRRC8A и демонстрируют большие АТФ-стимулированные, т.е. Ca ²⁺ , активированные токи TMEM16A Cl ^— и выраженные токи LRRC8 / VRAC Cl ^—, активируемые набуханием. LRRC8A (VRAC) и TMEM16A (CaCC) представляют собой независимые молекулярные образования и каналы Cl ^— , активируемые набуханием клеток или внутриклеточным Ca ²⁺ .Хотя белки TMEM16 не являются VRAC per se , предыдущие данные предполагают роль в I _{Cl , набухании} (Almaca et al., 2009; Juul et al., 2014; Benedetto et al., 2016; Sirianant et al. ., 2016a; Liu et al., 2019; Zhang et al., 2020). Анализ I _{Cl , набухание} в тканях мышей, лишенных экспрессии TMEM16A (Almaca et al., 2009), TMEM16F (Ousingsawat et al., 2015; Sirianant et al., 2016a) и TMEM16K (Hammer et al. ., 2015; Wanitchakool et al., 2017) показывает снижение I _{Cl , набухание} ) и снижение нормативного объема (RVD).Вклад TMEM16A и других TMEM16-белков в I _{Cl , набухание} и регуляцию объема зависит от клетки и может быть особенно значимым для высокодифференцированных нативных (не культивируемых) клеток. Не менее важны условия «заплатка-зажим», при которых измеряются I _{Cl , набухание} , что может объяснить некоторые из более ранних противоречивых результатов относительно роли TMEM16F (Almaca et al., 2009; Shimizu et al., 2013; Juul et al., 2014; Sirianant et al., 2016а).

Эксперименты с патч-зажимом показали более впечатляющие эффекты TMEM16A (и TMEM16F) на активацию VRAC при деполяризованных фиксирующих напряжениях. TMEM16A и TMEM16F в основном отменяют зависящую от времени инактивацию VRAC. Это также было подробно описано в предыдущем исследовании (Sirianant et al., 2016a). Таким образом, влияние TMEM16A менее заметно при отрицательных напряжениях фиксации и в условиях фиксации без напряжения. Тем не менее, даже при отрицательном мембранном напряжении влияние TMEM16A оказалось значительным (рисунок 6 и дополнительный рисунок S4).В то время как ряд транспортных свойств был приписан LRRC8 / VRAC (Planells-Cases et al., 2015; Lutter et al., 2017; Kang et al., 2018; Stuhlmann et al., 2018; Zhou et al., 2020) , его физиологическая значимость с точки зрения регуляции объема все еще остается предметом дискуссий. Мы обнаружили, что клетки способны выполнять RVD также в отсутствие LRRC8A (Milenkovic et al., 2015; Benedetto et al., 2016; Sirianant et al., 2016b), в то время как другие различные члены семейства TMEM16A, CFTR и котранспортер KCl KCC явно способствует регуляции объема (Sirianant et al., 2016b; Wanitchakool et al., 2016). Мы обнаружили, что активация I _{Cl , набухание} происходило быстро (в течение 1 минуты), что, однако, все же несколько задерживалось по сравнению с немедленным набуханием клеток (в пределах секунд) (Benedetto et al., 2016). Это предполагает дополнительные меры регулирования, помимо прямого открытия VRAC с помощью низкой ионной силы (Syeda et al., 2016). Другие и мы предложили Ca ²⁺ -зависимое развертывание кавеолоподобных мембранных резервов при набухании клеток и активации I _{Cl , набухания} (Groulx et al., 2006; Козера и др., 2009; Бенедетто и др., 2016).

Этот дополнительный механизм может потребовать увеличения Ca ²⁺ во внутриклеточном компартменте рядом с плазматической мембраной (Akita et al., 2011; Benedetto et al., 2016; Liu et al., 2019). Лю и др. показали, что внутриклеточный Ca ²⁺ необходим, но недостаточен для активации LRRC8A-опосредованных токов (Liu et al., 2019). Lemonnier и соавторы представили доказательства совместной локализации VRAC с управляемыми хранилищем каналами Ca ²⁺ и показали, что активация VRAC сильно зависит от высвобождения Ca ²⁺ через IP3R (Lemonnier et al., 2002). Они пришли к выводу, что VRAC регулируется внутри микродоменов Ca ²⁺ . Точно так же Акита и соавторы предположили, что каналы VRAC / VSOR могут быть активированы связанными с ПЛК GPCR, которые зависят от выпуска магазина Ca ²⁺ в непосредственной близости от канала (Akita and Okada, 2011), и предложили Ca ²⁺ нанодомен-опосредованный компонент VRAC (Akita et al., 2011).

Наши настоящие данные могут помочь прояснить роль белков TMEM16 в Ca ²⁺ -зависимой активации VRAC.Роль TMEM16A и других членов семейства TMEM16 в высвобождении ER Ca ²⁺ была обнаружена во многих тканях (Jin et al., 2016; Cabrita et al., 2017; Wanitchakool et al., 2017; Benedetto et al., al., 2019a; Centeio et al., 2020; Park et al., 2020). Высвобождение Ca ²⁺ , контролируемое TMEM16A, также важно для активации CFTR (Benedetto et al., 2017, 2019b; Park et al., 2020). Таким образом, вызванное набуханием клеток высвобождение Ca ²⁺ из ER и активация VRAC облегчается в присутствии белков TMEM16.Поскольку нокдаун TMEM16A, но не ингибирование TMEM16A с помощью Ani9, ослабляет активацию VRAC, это предполагает, что связывание ER с помощью TMEM16A, а не транспорта Cl ^— поддерживает активацию VRAC (Jin et al., 2013; Cabrita et al., 2017) .

Вдоль этой линии TMC8, член близкородственного семейства белков TMC, подобных трансмембранным каналам, также контролирует активацию VRAC и регуляцию объема (Sirianant et al., 2014). В зависимости от типа клеток высвобождение Ca ²⁺ , вызванное набуханием, активирует белки TMEM16 и CFTR (Thiele et al., 1998; Wanitchakool et al., 2016), что соответствует активации VRAC. Это обстоятельство может объяснить многие более ранние открытия, такие как фармакология перекрывающихся каналов Cl ^— (Koslowsky et al., 1994; Rottgen et al., 2018; Centeio et al., 2020).

Заявление о доступности данных

Необработанные данные, подтверждающие выводы этой статьи, будут предоставлены авторами без излишних оговорок любому квалифицированному исследователю.

Авторские взносы

RC, JO и RS провели эксперименты и проанализировали данные.Рукопись написали RC, RS и KK. Все авторы внесли свой вклад в статью и одобрили представленную версию.

Финансирование

Эта работа была поддержана Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Немецкий исследовательский фонд) номер проекта 387509280, SFB 1350 (проект A3), DFG KU756 / 14-1 и UK CF Trust SRC013.

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcell.2020.596879/full#supplementary-material

Список литературы

Акита Т., Федорович С.В., Окада Ю. (2011). Ca2 + нанодомен-опосредованный компонент индуцированного набуханием объемно-чувствительного внешне выпрямляющего анионного тока, запускаемого аутокринным действием АТФ в астроцитах мыши. Cell Physiol. Biochem. 28, 1181–1190.DOI: 10.1159 / 000335867

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Акита, Т., и Окада, Ю. (2011). Регулирование индуцированной брадикинином активации объемно-чувствительных внешне выпрямляющих анионных каналов с помощью нанодоменов Ca2 + в астроцитах мышей. J Physiol. 589, 3909–3927. DOI: 10.1113 / jphysiol.2011.208173

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Almaca, J., Tian, ​​Y., Aldehni, F., Ousingsawat, J., Kongsuphol, P., Рок, Дж. Р. и др. (2009). Белки TMEM16 производят регулируемые по объему хлоридные токи, которые снижаются у мышей, лишенных TMEM16A. J. Biol. Chem. 284, 28571–28578. DOI: 10.1074 / jbc.m109.010074

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бенедетто Р., Кабрита И., Шрайбер Р. и Кунцельманн К. (2019a). TMEM16A незаменим для выделения основной слизи в дыхательных путях и кишечнике. FASEB J. 33, 4502–4512. DOI: 10.1096 / fj.201801333rrr

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бенедетто Р., Ousingsawat, J., Cabrita, I., Pinto, M., Lerias, J., Wanitchakool, P., et al. (2019b). Белки TMEM16, локализованные на плазматической мембране, незаменимы для экспрессии CFTR. J. Mol. Med. 97, 711–722. DOI: 10.1007 / s00109-019-01770-4

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бенедетто Р., Усингсават Дж., Ванитчакул П., Чжан Ю., Хольцман М. Дж., Амарал М. и др. (2017). Транспорт эпителиального хлорида с помощью CFTR требует TMEM16A. Sci.Отчет 7: 12397. DOI: 10.1038 / s41598-017-10910-0

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бенедетто Р., Сирианант Л., Панкониен И., Ванитчакул П., Усингсават Дж., Кабрита И. и др. (2016). Связь между TMEM16A / аноктамином 1 и LRRC8A. Pflugers Arch. 468, 1751–1763. DOI: 10.1007 / s00424-016-1862-1

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кабрита, И., Бенедетто, Р., Фонсека, А., Ванитчакул, П., Сирианант Л., Скрябин Б.В. и др. (2017). Дифференциальные эффекты аноктаминов на внутриклеточные кальциевые сигналы. Faseb J. 31, 2123–2134. DOI: 10.1096 / fj.201600797rr

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кэннон, К. Л., Басаваппа, С., и Стрэндж, К. (1998). Внутриклеточная ионная сила регулирует объемную чувствительность активированного набуханием анионного канала. Am. J. Physiol. 275, C416 – C422. DOI: 10.1152 / ajpcell.1998.275.2.C416

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Центейо Р., Кабрита И., Бенедетто Р., Талби К., Усингсават Дж., Шрайбер Р. и др. (2020). Фармакологическое ингибирование и активация Ca (2+) активированного Cl (-) канала TMEM16A. Int. J. Mol. Sci. 21: 2557. DOI: 10.3390 / ijms21072557

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Денека, Д., Савица, М., Лам, А. К. М., Паулино, К., и Дутцлер, Р. (2018).Структура регулируемого по объему анионного канала семейства LRRC8. Природа 558, 254–259. DOI: 10.1038 / s41586-018-0134-y

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гулбинс, Э., Джекле, А., Ферлинц, К., Грассм, Х., и Ланг, Ф. (2000). Физиология апоптоза. Am .. J. Physiol. Почечный. Physiol. 279, F605 – F615. DOI: 10.1152 / ajprenal.2000.279.4.F605

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хаммер, К., Wanitchakool, P., Sirianant, L., Papiol, S., Monnheimer, M., Faria, D., et al. (2015). Кодирующий вариант ANO10, влияющий на регуляцию объема макрофагов, связан с серопозитивностью Borrelia. Мол. Med. 21, 26–37. DOI: 10.2119 / molmed.2014.00219

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Helix, N., Strobaek, D., Dahl, B.H., and Christophersen, P. (2003). Ингибирование эндогенного анионного канала с регулируемым объемом (VRAC) в клетках HEK293 кислыми диарилмочевинами. J. Membr. Биол. 196, 83–94. DOI: 10.1007 / s00232-003-0627-x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Исэ, Т., Симидзу, Т., Ли, Э. Л., Иноуэ, Х., Коно, К., и Окада, Ю. (2005). Роль чувствительного к объему Cl-канала в индуцированном цисплатином апоптозе в эпидермоидных раковых клетках человека. J. Membr. Биол. 205, 139–145. DOI: 10.1007 / s00232-005-0779-y

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Джин, X., Шах, С., Ду, X., Чжан, Х., Гампер, Н. (2016). Активация Ca2 + -активированного Cl- канала ANO1 локализованными сигналами Ca2 +. J. Physiol. 594, 19–30. DOI: 10.1113 / jphysiol.2014.275107

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Jin, X., Shah, S., Liu, Y., Zhang, H., Lees, M., Fu, Z., et al. (2013). Активация Cl-канала ANO1 локализованными сигналами кальция в ноцицептивных сенсорных нейронах требует взаимодействия с рецептором IP3. Sci.Сигнал. 6: ra73. DOI: 10.1126 / scisignal.2004184

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Джул, К. А., Грабб, С., Поулсен, К. А., Киед, Т., Хашем, Н., Ламберт, И. Х. и др. (2014). Аноктамин 6 отличается от VRAC и VSOAC, но участвует в апоптозе и поддерживает регуляцию объема в присутствии Ca. Pflugers Arch. 466, 1899–1910. DOI: 10.1007 / s00424-013-1428-4

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Канг, К., Xie, L., Gunasekar, S. K., Mishra, A., Zhang, Y., Pai, S., et al. (2018). SWELL1 — это датчик глюкозы, регулирующий возбудимость бета-клеток и системную гликемию. Nat. Commun. 9: 367. DOI: 10.1038 / s41467-017-02664-0

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Касуя, Г., Накане, Т., Йокояма, Т., Цзя, Ю., Иноуэ, М., Ватанабе, К., и др. (2018). Крио-ЭМ структуры регулируемого по объему анионного канала человека LRRC8. Nat. Struct. Мол. Биол. 25, 797–804.DOI: 10.1038 / s41594-018-0109-6

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кефовер, Дж. М., Саотоме, К., Дубин, А. Е., Паллесен, Дж., Коттрелл, К. А., Кахалан, С. М. и др. (2018). Структура анионного канала человека, регулируемого по объему. eLife 7: e38461. DOI: 10.7554 / eLife.38461.026

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Керн, Д. М., О, С., Хайт, Р. К., и Брохон, С. Г. (2019). Крио-ЭМ структуры DCPIB-ингибированного анионного канала LRRC8A с регулируемым объемом в липидных нанодисках. eLife 8: e42636.

Google Scholar

Koslowsky, T., Hug, T., Ecke, D., Klein, P., Greger, R., Gruenert, D. C., et al. (1994). Са2 + и отек вызывают активацию ионной проводимости в эпителиальных клетках бронхов. Pflügers Arch. 428, 597–603. DOI: 10.1007 / bf00374583

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Козера, Л., Уайт, Э., и Калаган, С. (2009). Кавеолы ​​действуют как мембранные резервы, которые ограничивают активацию механочувствительных каналов I (Cl, набухание) во время набухания в миоците желудочков крысы. PLoS One 4: e8312. DOI: 10.1371 / journal.pone.0008312

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кунцельманн, К., Усингсават, Дж., Бенедетто, Р., Кабрита, И., и Шрайбер, Р. (2019). Вклад аноктаминов в выживаемость и гибель клеток. Раки 19, E382.

Google Scholar

Lemonnier, L., Prevarskaya, N., Shuba, Y., Vanden Abeele, F., Nilius, B., Mazurier, J., et al. (2002). Модуляция Ca2 + анионных каналов с регулируемым объемом: свидетельство совместной локализации с каналами, управляемыми хранилищами. FASEB J. 16, 222–224.

Google Scholar

Lemonnier, L., Shuba, Y., Crepin, A., Roudbaraki, M., Slomianny, C., Mauroy, B., et al. (2004). Bcl-2-зависимая модуляция активированного набуханием тока Cl- и экспрессии ClC-3 в эпителиальных клетках рака простаты человека. Cancer Res. 64, 4841–4848. DOI: 10.1158 / 0008-5472.can-03-3223

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лю Т. и Штаубер Т. (2019). Регулируемый по объему анионный канал LRRC8 / VRAC незаменим для пролиферации и миграции клеток. Int. J. Mol. Sci. 20: 2663. DOI: 10.3390 / ijms20112663

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лю Ю., Чжан Х., Мэн Х., Ду Й., Сяо З., Чжан Ф. и др. (2019). Регулируемый по объему ток Cl (-): вклад отдельных каналов Cl (-) и локализованных сигналов Ca (2+). Am. J. Physiol. Cell Physiol. 317, C466 – C480.

Google Scholar

Лу, П., Дин, К., Ли, X., Цзи, X., Ли, Л., Фан, Ю. и др. (2019). SWELL1 способствует росту клеток и метастазированию гепатоцеллюлярной карциномы in vitro и in vivo. EBioMedicine 48, 100–116. DOI: 10.1016 / j.ebiom.2019.09.007

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Люттер, Д., Ульрих, Ф., Люк, Дж. К., Кемпа, С., и Йенч, Т. Дж. (2017). Селективный транспорт нейротрансмиттеров и модуляторов с помощью отдельных регулируемых по объему анионных каналов LRRC8. J. Cell Sci. 130, 1122–1133.

Google Scholar

Маккарти, Н. А., О’нейл, Р. Г. (1992). Сигнал кальция в регулировании объема. Physiol. Ред. 72, 1037–1061.

Google Scholar

Миленкович А., Брандл К., Миленкович В. М., Джендрике Т., Сирианант Л., Ванитчакул П. и др. (2015). Bestrophin1 представляет собой регулируемый по объему анионный канал в сперматозоидах мышей и пигментном эпителии сетчатки человека. Proc. Natl. Акад. Sci U.SA. 112, E2630 – E2639.

Google Scholar

Окада, Ю., Симидзу, Т., Маэно, Э., Танабэ, С., Ван, X. и Такахаши, Н. (2006). Чувствительные к объему хлоридные каналы, участвующие в уменьшении объема апоптоза и гибели клеток. J. Membr. Биол. 209, 21–29. DOI: 10.1007 / s00232-005-0836-6

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Усингсават, Дж., Ванитчакул, П., Кмит, А., Ромао, А. М., Джантараджит, В., Шрайбер, С., и др. (2015). Аноктамин 6 опосредует эффекты, необходимые для врожденного иммунитета ниже рецепторов P2X7 в макрофагах. Nat. Commun. 6: 6245.

Google Scholar

Park, J. H., Ousingsawat, J., Cabrita, I., Bettels, R.E., Große-Onnebrink, J., Schmalstieg, C., et al. (2020). Дефицит TMEM16A: потенциально смертельное неонатальное заболевание, возникающее в результате нарушения хлоридного тока. J. Med. Genet. Jmedgenet-2020-106978. [Epub перед печатью].

Google Scholar

Педерсен, С. Ф., Окада, Ю., и Нилиус, Б. (2016). Биофизика и физиология анионного канала с регулируемым объемом (VRAC) / объемно-чувствительного наружно выпрямляющего анионного канала (VSOR). Pflugers Arch. 468, 371–383.DOI: 10.1007 / s00424-015-1781-6

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Planells-Cases, R., Lutter, D., Guyader, C., Gerhards, N. M., Ullrich, F., Elger, D. A., et al. (2015). Субъединичный состав каналов VRAC определяет субстратную специфичность и клеточную устойчивость к противораковым препаратам на основе Pt. EMBO J. 34, 2993–3008. DOI: 10.15252 / embj.2015

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Цю, З., Дубин, А.Э., Матур, Дж., Ту, Б., Редди, К., Миралья, Л. Дж. И др. (2014). SWELL1, белок плазматической мембраны, является важным компонентом регулируемого по объему анионного канала. Ячейка 157, 447–458. DOI: 10.1016 / j.cell.2014.03.024

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Роттген, Т. С., Никерсон, А. Дж., И Раджендран, В. М. (2018). Активированный кальцием канал Cl (-): понимание молекулярной идентичности эпителиальных тканей. Int. J. Mol. Sci. 19: 1432. DOI: 10.3390 / ijms132

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сабиров Р. З., Пренен Дж., Томита Т., Дроогманс Г. и Нилиус Б. (2000). Снижение ионной силы активирует одиночные регулируемые по объему анионные каналы (VRAC) в эндотелиальных клетках. Pflugers Arch. 439, 315–320. DOI: 10.1007 / s004240050945

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Schreiber, R., Ousingsawat, J., Wanitchakool, P., Sirianant, L., Бенедетто Р., Рейсс К. и др. (2018). Регулирование ионных токов TMEM16A / ANO1 и TMEM16F / ANO6 и скремблирования фосфолипидов с помощью Ca2 + и липидов плазматической мембраны. J. Physiol. 596, 217–229. DOI: 10.1113 / JP275175

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Со, Й., Ли, Х. К., Пак, Дж., Чон, Д. К., Джо, С., Джо, М., и др. (2016). Ani9, новый мощный низкомолекулярный ингибитор ANO1 с незначительным влиянием на ANO2. PLoS One 11: e0155771.DOI: 10.1371 / journal.pone.0155771

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Симидзу Т., Иехара Т., Сато К., Фуджи Т., Сакаи Х. и Окада Ю. (2013). TMEM16F является компонентом Ca2 + -активированного канала Cl-, но не чувствительного к объему, выпрямляющего наружу канала Cl-. Am. J. Physiol Cell Physiol. 304, C748 – C759.

Google Scholar

Sirianant, L., Ousingsawat, J., Tian, ​​Y., Schreiber, R., and Kunzelmann, K. (2014).TMC8 (EVER2) ослабляет внутриклеточную передачу сигналов Zn2 + и Ca2 + и подавляет активацию токов Cl-. Cell Signal. 26, 2826–2833. DOI: 10.1016 / j.cellsig.2014.09.001

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Sirianant, L., Ousingsawat, J., Wanitchakool, P., Schreiber, R., and Kunzelmann, K. (2016a). Регулирование клеточного объема с помощью аноктамина 6: Ca2 +, фосфолипаза A2, осмосенсинг. Pflügers Arch. 468, 335–349. DOI: 10.1007 / s00424-015-1739-8

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сирианант, Л., Wanitchakool, P., Ousingsawat, J., Benedetto, R., Zormpa, A., Cabrita, I., et al. (2016b). Несущественный вклад LRRC8A в регулирование объема. Pflügers Arch. 468, 1789–1796.

Google Scholar

Стрэндж К., Ямада Т. и Дентон Дж. С. (2019). 30-летний путь от регулируемых по объему анионных токов к молекулярной структуре канала LRRC8. J. Gen. Physiol. 151, 100–117. DOI: 10.1085 / jgp.201812138

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Штульманн, Т., Planells-Cases, R., and Jentsch, T. J. (2018). Анионные каналы LRRC8 / VRAC усиливают чувствительность бета-клеток к глюкозе и секрецию инсулина. Nat. Commun. 9; 1974.

Google Scholar

Syeda, R., Qiu, Z., Dubin, A. E., Murthy, S. E., Florendo, M. N., Mason, D. E., et al. (2016). Белки LRRC8 образуют регулируемые по объему анионные каналы, которые определяют ионную силу. Ячейка 164, 499–511. DOI: 10.1016 / j.cell.2015.12.031

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Тиле, И.Э., Хуг М. Дж., Хюбнер М. и Грегер Р. (1998). Экспрессия регулятора трансмембранной проводимости при муковисцидозе изменяет ответ на набухание гипотонических клеток и АТФ клеток яичников китайского хомячка. Cell Physiol. Biochem. 8, 61–74. DOI: 10.1159 / 000016271

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Фон Клейст, С., Чани, Э., Буртин, П., Кинг, М., и Фог, Дж. (1975). Иммуногистология антигенного паттерна непрерывной клеточной линии опухоли толстой кишки человека. J. Natl. Cancer Inst. 55, 555–560. DOI: 10.1093 / jnci / 55.3.555

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Voss, F. K., Ullrich, F., Munch, J., Lazarow, K., Lutter, D., Mah, N., et al. (2014). Идентификация гетеромеров LRRC8 как важного компонента регулируемого по объему анионного канала VRAC. Наука 344, 634–638. DOI: 10.1126 / science.1252826

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ванитчакул, П., Ousingsawat, J., Sirianant, L., Cabrita, I., Faria, D., Schreiber, R., et al. (2017). Клеточные дефекты из-за делеции ANO10 обусловлены нарушением регуляции локальной передачи сигналов кальция. Cell Signal. 30, 41–49. DOI: 10.1016 / j.cellsig.2016.11.006

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ванитчакул П., Усингсават Дж., Сирианант Л., Маколей Н., Шрайбер Р. и Кунцельманн К. (2016). Cl- каналы в апоптозе. Eur. Биофиз. J. 45, 599–610.DOI: 10.107 / s00249-016-1140-3

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Янг, Х., Ким, А., Дэвид, Т., Палмер, Д., Джин, Т., Тиен, Дж. И др. (2012). TMEM16F образует Ca (2 +) — активированный катионный канал, необходимый для скремблирования липидов в тромбоцитах во время свертывания крови. Ячейка 151, 111–122. DOI: 10.1016 / j.cell.2012.07.036

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чжан Х., Лю Ю., Мэн Х., Чжан Ф. и Чжан Х. (2020). LRRCA8A и ANO1 вносят вклад в индуцированный сывороткой VRAC Ca (2 +) — зависимым образом. J. Pharmacol. Sci. 143, 176–181. DOI: 10.1016 / j.jphs.2020.04.003

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Zhou, C., Chen, X., Planells-Cases, R., Chu, J., Wang, L., Cao, L., et al. (2020). Перенос цГАМФ в клетки-свидетели через анионные каналы с регулируемым объемом LRRC8 усиливает опосредованные укусами интерфероновые ответы и противовирусный иммунитет. Иммунитет 52, 767.e6–781.e6.

Google Scholar

Узнайте о доходах из предыдущего / текущего отчета CL / CA

1. Последнее обновление

2. Сохранить как PDF

1. Обзор
2. Прочие связанные отчеты
   1. Отчет RC Rollforward
   2. Waterfall Report
   3. Unbill RollForward Report
3. Связанные статьи

В соответствии с требованиями ASC 606, выручка должна быть раскрыта на основе следующего отчетного периода категорий:

• Выручка предыдущего периода по счету баланса обязательств по договору

• Выручка предыдущего периода по балансовому счету Контрактных активов

• Выручка текущего периода по счету баланса обязательств по договору

• Выручка текущего периода по балансовому счету Контрактных активов

• Чистая выручка за текущий период

• Истинный доход со счета баланса дебиторской задолженности без выставления счетов

Чтобы соответствовать требованиям к раскрытию информации, Zuora Revenue предоставляет отчет о доходах от предыдущего / текущего отчета CL / CA, чтобы вы могли видеть правильные значения раскрытия информации для контракта на выручку.Поскольку существуют различные интерпретации руководства по раскрытию информации ASC 606, этот отчет разработан с учетом наиболее распространенных требований к раскрытию информации.

Примечание: Отчет о доходах от предыдущего / текущего CL / CA доступен только на уровне контракта на выручку.

В документации к этому разделу используются следующие сокращения, а также в заголовках столбцов отчета:

Обзор

В отчете «Доход от предыдущего / текущего CL / CA» следующие данные взяты из некоторых других отчетов и представлены в этом отчете:

На основе вышеуказанных точек данных можно рассчитать следующие две точки данных и представить их в отчете о доходах от предыдущего / текущего отчета CL / CA:

• Чистое добавление CA / CL = Общее количество добавлений (отчет RC Rollforward) — Неучтенные счета (сумма из строк транзакции права на выставление счета в отчете Unbill RollForward)

• Чистый выпуск CA / CL = общий выпуск (отчет RC Rollforward) — Неучтенные счета (сумма из строк транзакции права на выставление счета в отчете Unbill RollForward)

Затем чистый выпуск CA / CL в текущем периоде будет разделен на PP CA / CL и / или CP CA / CL, которые также представлены в этом отчете следующим образом:

Общий доход в этом отчете представляет собой сумму PP CL, PP CA, CP CL, CP CA и невыплаченного дохода от AR. Когда вы выполняете сверку отчета, общий доход в предыдущем / текущем отчете CL / CA должен быть равен чистому доходу в водопадном отчете.

Прочие связанные отчеты

Чтобы понять, как рассчитывается доход от предыдущего / текущего отчета CL / CA, требуются следующие отчеты, тесно связанные с отчетом «Доход от предыдущего / текущего отчета CL / CA».

Отчет о повторении транзакций с дистанционным управлением

Этот отчет может отображать начальное и конечное сальдо CA / CL и операции за текущий период. Общие добавления, общий выпуск и конечный баланс важны для получения чистых добавлений CA / CL и чистого выпуска CA / CL для дохода из предыдущего / текущего отчета CL / CA.

Отчет о водопаде

В этом отчете может отображаться график амортизации чистой выручки, которая представляет собой сумму выручки по договору и выручки от корректировок. Чистый доход в отчете Waterfall и общий выпуск в отчете RC Rollforward используются для расчета незарегистрированного AR для дохода из предыдущего / текущего отчета CL / CA.

Отчет о выставлении счетов за пересылку

При вычислении общего количества добавлений и общего выпуска из отчета RC Rollforward также включаются строки транзакции с флагом «Право на выставление счета», установленным на Y.Согласно ASC 606, для получения истинных чистых добавлений CA / CL и чистого выпуска CA / CL для текущего периода, выручка от строк транзакций с правом выставления счета должна быть исключена. Столбец Незавершенные счета в Отчете по авансированию не выставленных счетов указывает счета, которые связаны со строками транзакции права на выставление счета.

Статьи по теме

• Для получения подробных объяснений ключевых точек данных, задействованных в этом отчете, см. Ключевые точки данных.

• Чтобы понять внутреннюю логику вычислений этого отчета, см. Логика вычислений.

• Образец контракта на выручку показывает, как создается отчет. Для получения дополнительной информации см. Пример контракта на выручку.

Cruiser Photo Index CL / CA-30 USS HOUSTON — Navsource

Роль белков CLCA в воспалительном заболевании дыхательных путей

В этом разделе мы рассмотрим модели клеток и животных, которые были изучены для определения роли белков CLCA в развитии воспалительных заболеваний дыхательных путей.Однако еще до того, как была начата работа по изучению функции CLCA в легких, в нескольких сообщениях предполагалось, что белки CLCA могут играть роль супрессоров опухолей. Например, исследования меланомы на мышах показали, что характер метастазирования коррелирует с участками экспрессии Clca, и что антитела против Clca блокируют метастазирование в легкое (19, 45). Кроме того, у мышей, иммунизированных очищенным bClca2, развивалась устойчивость к метастазам (46). Другие исследования показали, что в клетках рака груди человека отсутствует обычная экспрессия экспрессии hCLCA2, а сверхэкспрессия hCLCA2 снижает способность этих клеток к инвазии и образованию опухолей у голых мышей (47).Точно так же клетки рака молочной железы мыши экспрессировали уменьшенное количество mClca1, mClca2 и mClca5, а повторная экспрессия или сверхэкспрессия этих белков снижала рост клеток и повышала чувствительность к апоптозу (36, 48). Связанная работа показала, что взаимодействие между hCLCA2 на эндотелиальных клетках и его лигандом бета-4 интегрина на клетках рака молочной железы может опосредовать более агрессивное поведение опухоли (41, 43, 49). Точно так же члены семейства CLCA с функциональными доменами связывания интегрина бета-4 могут использовать этот механизм для активации передачи сигналов киназы фокальной адгезии к киназе, регулируемой внеклеточными сигналами (ERK), с потенциалом регулирования выживаемости клеток (42, 43).Снижение экспрессии hCLCA2 также наблюдается в образцах рака груди, и это снижение, по-видимому, связано с метилированием ДНК (50). Недавняя работа также показывает, что ген hCLCA2 может быть удален в образцах лимфомы из клеток мантии (51). Эти исследования подчеркивают возможную роль hCLCA2 как супрессора опухолей и закладывают основу для исследований hCLCA1 при воспалительных заболеваниях дыхательных путей. Связь между активностью белков CLCA как супрессоров опухолей и иммуномодификаторов не изучена.

Модели изолированных клеток

Исследования изолированных клеток, возможно, были первыми, в которых была выявлена ​​роль белков CLCA в иммунитете.В частности, сверхэкспрессия mClca3 или hCLCA1 в линии мукоэпидермоидных клеток человека NCI-h392 вызывает значительное увеличение продукции муцина (52, 53). Эти данные свидетельствуют о том, что белки CLCA могут регулировать уровень выработки слизи и, как следствие, эффективность мукоцилиарного клиренса частиц и микробных патогенов. Используя эту клеточную модель, исследователи изучили возможность того, что белки CLCA работают как ионные каналы, чтобы каким-то образом влиять на выработку слизи. Например, исследователи использовали нифлуминовую кислоту (препарат, который якобы является специфическим ингибитором активности хлоридных каналов), чтобы блокировать увеличение продукции муцина, обнаруженное в клетках NCI-h392, которые экспрессируют hCLCA1 (53).В связанной работе другая группа показала, что нифлумовая кислота подавляет АТФ-опосредованный экзоцитоз муцина в клетках HT29-Cl.16E (54). Точно так же Макнамара и его коллеги обнаружили, что индукция аденозином биосинтеза муцина зависит от трансактивации рецептора EGF, и что нифлумовая кислота ингибирует этот тип трансактивации (55). Другая работа с производным нифлумовой кислоты MSI-2216 также продемонстрировала ингибирование образования слизи (56, 57). Эти исследования сделали вывод о роли белков CLCA в сигнальном пути, ведущем к синтезу и секреции муцина, но не предоставили прямых доказательств того, как белки CLCA могут участвовать в этом процессе.Поскольку структурный анализ теперь показывает, что белки CLCA сами по себе не могут быть мембранными ионными каналами, существует потребность в более подробном изучении того, как белки CLCA могут контролировать развитие слизистых клеток.

Хотя был достигнут некоторый прогресс в установлении роли hCLCA1 в метаплазии слизистых клеток на изолированных клеточных моделях, имеется мало информации о функции CLCA в культурах гладких мышц дыхательных путей. Возможно, что белки CLCA могут влиять на поведение гладкой мускулатуры дыхательных путей, поскольку антисмысловые олигонуклеотиды, которые подавляют экспрессию mClca, по-видимому, ингибируют гиперреактивность дыхательных путей у мышей, зараженных овальбумином (52).Имеющиеся отчеты показывают, что hCLCA1 (и гомологичный mClca3) локализованы в гранулах муцина слизистых клеток в легких, желудочно-кишечном тракте и матке и не экспрессируются в гладких мышцах дыхательных путей (28, 34, 58, 59). Однако mClca4 экспрессируется на значительном уровне в гладких мышцах дыхательных путей мышей (35). Кроме того, поток хлоридов, активируемый кальцием, обнаруживается в гладких мышцах сосудистой сети, уретры и лимфатических сосудах (60–62). Поскольку по крайней мере некоторые белки CLCA / Clca могут деполяризовать клеточные мембраны (15), возможно, что экспрессия CLCA в гладких мышцах дыхательных путей может привести к сужению бронхов.Как и в случае со слизистыми клетками, функция CLCA в гладкомышечных клетках все еще требует определения.

Модели на животных

Возможно, лучшее доказательство биологической роли белков Clca было получено на животных моделях воспалительного заболевания дыхательных путей. В этом случае серия исследований установила связь между экспрессией белков Clca в легких и развитием воспалительного заболевания дыхательных путей. Одно из первых сообщений было получено при исследовании модели аллергической астмы на мышах, которая зависит от сенсибилизации и последующей ингаляционной провокации овальбумином.Используя эту модель, сообщалось, что mClca3, по-видимому, регулирует метаплазию слизистых клеток и гиперреактивность дыхательных путей (52). В этих условиях развитие метаплазии слизистых клеток и гиперреактивности дыхательных путей ингибировалось введением полноразмерного антисмыслового олигонуклеотида mClca3 , доставляемого с аденовирусной векторной системой. Эти исследователи не осознавали, что эта полноразмерная конструкция может также взаимодействовать с общими гомологиями последовательностей у других членов семейства mClca.Тем не менее, экспрессия mClca3 в эпителии дыхательных путей была достаточной, чтобы вызвать метаплазию слизистых клеток и гиперреактивность дыхательных путей у этих животных. Это открытие согласуется с доказательствами того, что экспрессии mClca3 было достаточно, чтобы управлять продукцией муцина в клетках NCI-h392 (52, 53).

В дополнение к этим исследованиям аллергической астмы на мышах, другая группа изучала роль белков Clca в развитии аллергического астматического заболевания у лошадей. У этого вида развивается заболевание эпизодической рецидивирующей обструкции дыхательных путей (также известное как вздутие), которое также проявляется метаплазией слизистых клеток и гиперреактивностью дыхательных путей (63–65).Патогенез этого заболевания лошадей также включает продукцию цитокинов Th3 (особенно IL-4 и IL-13) (66). Кроме того, как и заболевание дыхательных путей, которое развивается у мышей и людей, Muc5ac является преобладающим муцином дыхательных путей, который экспрессируется во время развития метаплазии слизистых клеток (67). Таким образом, заболевание лошадей проявляет характерные черты астмы и ХОБЛ у человека, а также модели хронического заболевания дыхательных путей, вызванные аллергеном и вирусной инфекцией у мышей (68). Следовательно, казалось вероятным, что лошадиные белки Clca также будут вовлечены в патобиологию метаплазии слизистых клеток астматического заболевания, развивающегося у лошадей.Действительно, исследователи сообщают о значительном увеличении экспрессии eClca1 в эпителии дыхательных путей лошадей с рецидивирующей обструкцией дыхательных путей у лошадей (25, 69).

В рамках особого подхода к пониманию основ воспалительного заболевания дыхательных путей наша лаборатория также пришла к оценке роли генного семейства Clca (24). Наша группа стремилась генетически отделить метаплазию слизистых клеток от гиперреактивности дыхательных путей на мышиной модели и, таким образом, идентифицировать молекулярный путь, который может быть связан с одним признаком заболевания.Другие также использовали инбредные линии мышей для определения генетического влияния на заболевание дыхательных путей, но эта работа в основном сосредоточена на развитии гиперреактивности дыхательных путей (70–78). В обычном случае эти предыдущие исследования были направлены на определение генетического локуса для одного количественного признака, а не на отделение одного признака от другого в сложном фенотипе. Более того, обычная модель заражения аллергеном при заболевании дыхательных путей не часто учитывала хроническую природу фенотипа. Принимая во внимание хорошо описанную роль респираторно-синцитиального вируса (RSV), а также других вирусов в хроническом заболевании дыхательных путей (79–84), мы разработали мышиную модель вирусного бронхиолита.Инфекционным агентом, используемым в этой модели, является вирус Сендай (SeV), вирус парагриппа мышей, похожий на другие парамиксовирусы, которые чаще инфицируют людей. Однако мыши относительно устойчивы к заражению патогенами человека, такими как RSV. Напротив, SeV реплицируется с высокой эффективностью в легких мыши, а инфекция SeV вызывает повреждение и воспаление мелких дыхательных путей (то есть бронхиолит), что неотличимо от аналогичного состояния у людей. За этой острой реакцией следует отсроченное, но необратимое переключение на хроническое заболевание дыхательных путей, которое характеризуется образованием слизи (метаплазия слизистых клеток) и повышенной реактивностью дыхательных путей на вдыхаемый метахолин (гиперреактивность дыхательных путей) (24, 85, 86).Мы пришли к выводу, что оба эти признака индуцируются на долгосрочной основе после вирусного бронхиолита у инбредных мышей линии C57BL / 6J (86). Напротив, мы обнаружили, что штамм Balb / cJ реагировал аналогичным образом во время острой инфекции, но не смог развить никаких хронических заболеваний дыхательных путей (24).

Мы воспользовались этим различием в генетической предрасположенности для создания популяции кросс-кросса F2 с фенотипическими крайностями, которые проявляют тот или иной признак заболевания, и проанализировали эти крайние значения для экспрессии генов с использованием олигонуклеотидных микрочипов (24).Эта комбинированная генетическая и геномная стратегия предоставила доказательства избирательной связи между экспрессией члена семейства генов mClca , т.е. mClca3 , с развитием метаплазии слизистых клеток, но не гиперреактивностью дыхательных путей. В подтверждение взаимосвязи между экспрессией mClca3 и метаплазией слизистых клеток мы также обнаружили, что перенос гена mClca3 в дыхательные пути мыши (с использованием аденоассоциированного вирусного вектора) был достаточен для образования метаплазии слизистых клеток, но не вызвал прохождения в дыхательных путях гиперреактивность (24).Затем мы создали мышь, гомозиготную по целевой нулевой мутации гена mClca3 ( mClca3 ^{— / —} ). Однако у мышей mClca3, ^{— / —} развилась такая же степень метаплазии слизистых клеток (и гиперреактивности дыхательных путей), что и у мышей дикого типа, как на вирусных моделях хронического заболевания дыхательных путей, так и на моделях с аллергеном (24).

Так как экспрессия гена mClca3 была достаточной, но не необходимой для развития метаплазии слизистых клеток, мы пришли к выводу, что другой механизм также должен быть способен опосредовать хроническое изменение поведения дыхательных путей.Мы специально задались вопросом, может ли другой ген mClca быть ответственным за такой эффект. Соответственно, мы использовали программу BLAST (87) для поиска гомологов гена mClca3 и, следовательно, обнаружили четыре дополнительных гена mClca , фланкирующих mClca3 на хромосоме 3 мыши. Мы предварительно назвали эти гены mClca5 , mClca6 , mClca7 и mClca8 ; и впоследствии эти гены получили те же обозначения (23, 88) с гомологией с членами семейства CLCA человека, как показано на.Поскольку другие члены семейства mClca также экспрессируются в ткани дыхательных путей (88, 89), они могут компенсировать потерю mClca3 и тем самым способствовать развитию метаплазии слизистых клеток в условиях дефицита mClca3 (24). Действительно, мы недавно показали, что члены семейства mClca могут проявлять функциональную избыточность в развитии воспалительного заболевания дыхательных путей. В частности, экспрессия mClca5 также увеличивалась вместе с метаплазией слизистых клеток и гиперреактивностью дыхательных путей после вирусной инфекции (24).Кроме того, переноса гена mClca5 в эпителий дыхательных путей было достаточно, чтобы вызвать метаплазию слизистых клеток, но не гиперреактивность дыхательных путей (24). Предварительные исследования показывают, что экспрессия mClca6 в эпителии дыхательных путей также достаточна для метаплазии слизистых клеток, но не гиперреактивности дыхательных путей (90).

Другая группа также признала, что дефицит mClca3 сам по себе не влияет на развитие метаплазии слизистых клеток после заражения аллергеном, но их анализ генетической компенсации был ограничен уровнями экспрессии mClca1, mClca2 и mClca4 (91).Фактически, наша работа показывает, что mClca5, mClca6 и mClca7 являются более подходящими кандидатами на компенсаторную функцию. Учитывая обширную гомологию последовательностей членов семейства mClca, вероятно, что mClca3, антисмысловые олигонуклеотиды могут связываться и ингибировать несколько членов семейства. В этих условиях нокдаун гена mClca может ингибировать индукцию метаплазии слизистых клеток и гиперреактивности дыхательных путей после вирусной инфекции, но эта возможность все еще требует формального тестирования.

Точные сигналы, которые регулируют экспрессию гена mClca на мышиных моделях воспалительного заболевания дыхательных путей, также изучаются. Большинство исследований показывают, что цитокины Th3 (IL-4, IL-9 и IL-13) вызывают повышенную экспрессию белков CLCA в культуре клеток (53, 92–94). Однако по крайней мере одна группа не обнаруживает этой взаимосвязи (94, 95), предполагая, что состояние культивируемых клеток может влиять на реакцию на цитокин. Например, степень дифференцировки клеток может влиять на экспрессию рецептора цитокина или сигнальную функцию рецептора.Действительно, экспрессия рецептора IL-13 и его сигнальная функция могут быть критическими детерминантами метаплазии слизистых клеток после вирусной инфекции (96). В этом отношении фактор транскрипции Stat6, который передает сигнал от рецепторов IL-4 и IL-13, также необходим для усиления экспрессии гена CLCA (93). Точно так же повышенная экспрессия Clca развивается вместе с повышенной экспрессией IL-13 в мышиных моделях заболеваний дыхательных путей, вызванных вирусами и аллергенами (24, 52, 91, 96, 97). Более того, повышенная экспрессия Clca развивается после инстилляции IL-13 в легкие и у трансгенных мышей IL-13 (93, 94, 98, 99).Таким образом, сигналы цитокинов Th3 служат для регулирования экспрессии гена CLCA в различных условиях. Этот стимулирующий эффект IL-13 может зависеть от сайтов связывания Stat6 в промоторе гена CLCA, но точный биохимический механизм еще предстоит определить.

clcA — H (+) / Cl (-) обменный переносчик ClcA — Escherichia coli (штамм K12)

Этот подраздел «Патология и биотехнология» описывается влияние экспериментальной мутации одной или нескольких аминокислот на биологические свойства белка. p> Подробнее …

openxpki / clca: ЦС командной строки, включая загрузочный носитель корневого ЦС и общий доступ к секретам

Авторские права (c) 2004-2018 Мартин Бартош, WhiteRabbitSecurity GmbH

Это программное обеспечение распространяется под Стандартной общественной лицензией GNU — см. сопроводительный файл ЛИЦЕНЗИИ для получения более подробной информации.

Введение

Это набор инструментов, которые позволяют использовать базовую инфраструктуру PKI. такие операции, как выдача сертификата Sub CA (подписание сертификата запросы), отзыв сертификата и выдача CRL. Скрипт изначально был разработан для использования в корневом центре сертификации, но может также может использоваться для центров сертификации нижнего уровня или даже для сертификатов конечных объектов.

CA могут храниться в зашифрованных файлах (зашифрованных с помощью простую парольную фразу или с помощью Shamir’s Secret Sharing) или хранятся в HSM.

Скрипт был успешно протестирован с

• Thales nCipher nShield HSM
• Gemalto SafeNet Luna SA HSM

Обратите внимание, что этот сценарий не поддерживает одновременное использование несколько сеансов. Следует ожидать непредсказуемого поведения, если два экземпляры сценария CA выполняются одновременно.

Быстрый старт: создание CA

С помощью этого сценария можно обрабатывать произвольное количество экземпляров CA.

• Для каждого CA создайте новый каталог верхнего уровня и перейдите в этот каталог.В этом каталоге создайте каталог etc и скопируйте содержимое каталога sample etc из дистрибутива CLCA.

• Измените конфигурацию CA etc / clca.cfg в соответствии со своими потребностями. Задавать ENGINE, если требуется для поддержки HSM или программного обеспечения CA.

• Измените etc / openssl.cnf в соответствии с политикой вашего центра сертификации и сертификатом. профиль (см. «Конфигурация»)

• Создать корневой ключ (см. «Генерация корневого ключа»)

• Создать самозаверяющий сертификат ЦС ИЛИ

• Создать запрос сертификата ЦС, экспортировать его в ЦС более высокого уровня и импортировать сертифицированный сертификат CA

Генерация корневого ключа

Требуется только для поддержки nCipher HSM:

• Установите модуль nCipher и программное обеспечение.
• Создайте мир безопасности
• Создание набора карточек администратора
• Создайте набор карт оператора, защищающий ваш корневой ключ
• Создайте корневой ключ с помощью generatekey2 hwcrhk

Требуется только для поддержки HSM Gemalto SafeNet Luna SA:

• Установить драйверы HSM
• Установить доверительную ссылку на Luna SA HSM
• Получите документ поддержки Gamalto SafeNet DOW4073 (или более новый документ, содержащий OpenSSL драгоценный двигатель)
• Установите OpenSSL Engine и инструмент командной строки sautil

Требуется только для программной поддержки CA с простой парольной фразой:

• создать частный каталог в $ CA_HOME
• адаптирует имя ключа RSA в clca.cfg
• запустить openssl genrsa -des3 $ CA_HOME / private /

См. README.keyceremony-shared-interactive.md для примера использования совместного использования секретов.

Конфигурация

Отредактируйте etc / clca.cfg и etc / openssl.cnf в соответствии с вашими потребностями, в частности, профиль сертификата и другие параметры политики.

Обратите внимание, что инициализация CA заботится об установке правильные пути в openssl.cnf, поэтому ручное изменение не необходимо для этого раздела.

Базовое использование и получение помощи

Система CA содержится в одном скрипте ( bin / clca ). Если вызывается без аргументов, он печатает обзор поддерживаемых команды. Чтобы получить онлайн-справку по определенной команде, используйте

$ clca help КОМАНДА или $ clca КОМАНДА - помощь

Ввод PIN-кода

Если используется HSM, ввод PIN-кода обычно обрабатывается командой предварительной загрузки. который, в свою очередь, вызывает OpenSSL. Таким образом, конфигурационная переменная HSM_PRELOAD должен быть установлен на соответствующий исполняемый файл, который позволяет открывать HSM для операций с закрытым ключом.

Инициализация CA

Перед использованием системы необходимо создать центр сертификации. Это необходимо только однажды.

Для первоначальной настройки нового центра сертификации необходимо выполнить следующие действия:

Убедитесь, что настройки etc / clca.cfg и etc / openssl.cnf в порядке.

Бег

$ clca initialize --startdate DATESPEC --enddate DATESPEC

Скрипт выполняет несколько проверок работоспособности и отказывается перезаписывать существующий центр сертификации.Если сертификаты ЦС были удалены вручную из каталога ca / ​​ автоматически создается резервная копия существующего центра сертификации. в каталог attic / и создается новый центр сертификации.

Дата начала и дата окончания указаны в часовом поясе UTC. Обратите внимание, что год должен быть указан только двумя цифрами!

Дата / время могут быть указаны в усеченной форме, опуская любое количество «правых» компонентов даты / времени (например, «ГГММ»).

Выполните clca help datepec для получения дополнительных сведений о спецификации даты.

Если вы не используете HSM, вам будет предложено ввести PIN-коды, защищающие закрытый ключ CA во время создания CA.

После настройки CA обязательно сделайте резервную копию ключа CA и база данных сертификатов. Если ключ утерян, новых сертификатов или списков отзыва сертификатов не будет. может быть оформлен.

Подписание запросов на сертификат

Позвонить

$ clca certify --profile PROFILE [--startdate DATESPEC --enddate DATESPEC] <файл запроса>

для подтверждения запроса PKCS # 10.Формат запроса (DER / PEM) определяется автоматически.

Обратите внимание, что --profile является обязательным и должен ссылаться на раздел в openssl.cnf файл, который содержит ссылку x509_extensions и НЕ содержит отличительного_имя или ссылка crl_extensions.

Можно переопределить DN субъекта и добавить в запрос SubjectAlternativeNames. За подробностями обращайтесь к тексту справки по команде.

Параметры startdate и enddate являются необязательными и указываются в часовом поясе UTC.Обратите внимание, что год необходимо указывать только двумя цифрами!

Дата / время могут быть указаны в усеченной форме, опуская любое количество «правых» компонентов даты / времени (например, «ГГММ»).

Выполните clca help datepec для получения дополнительных сведений о спецификации даты.

Если начальная / конечная дата не указана, используется действительность по умолчанию из профиля.

Пропуск начальной и конечной даты рекомендуется только для сертификатов конечных объектов, используйте явную действительность для любого сертификата, который используется в качестве CA.

Полученный сертификат помещается в каталог certs /. Копия самого последнего сертификата также записывается в newcert.pem в текущий рабочий каталог.

Отзыв сертификатов

Для отзыва сертификата звоните

$ clca revoke <серийный номер>

Это позволит идентифицировать сертификат в базе данных сертификатов (certs / каталог) и отметьте сертификат как отозванный.

Листинговые свидетельства

Звонок

$ clca list <фильтр>

перечисляет все сертификаты, соответствующие указанному фильтру.Фильтр может быть пустым, либо «действительным», либо «отозванным». Если фильтр не указан, все сертификаты распечатываются по стандарту

Выдача CRL

Для создания нового списка отзыва сертификатов

$ clca issue_crl

Это создаст новый CRL и запишет его в каталог crls / ГГГГММДДЧЧММСС.crl . (Заглавные буквы заменяются на текущая отметка времени.)

Срок действия CRL настраивается в файле etc / openssl.cnf.

Вход по ключу CA

Если несколько команд clca должны выполняться подряд (например,г. для подписания нескольких сертификатов) можно ввести подоболочку, в которой кэшируется ключевая фраза-пароль CA.

Работает

$ clca логин

сначала запросит ключевую фразу CA, а затем перейдет в подоболочку. Можно выполнить любое количество команд clca, для которых требуется кодовая фраза CA, без повторного ввода ключевой фразы.

Введите exit , чтобы покинуть эту оболочку.

Проверка целостности программного обеспечения

Проверка целостности конфигурации и всех необходимых внешних программ можно выполнить, запустив

$ clca чек

Эта команда сообщит индивидуальные контрольные суммы для конфигурации. файлы и одна составная контрольная сумма для всех внешних утилит UNIX используется сценарием.

Создание резервных копий ЦС

В любой момент можно создать снимок текущего статуса CA, включая базу данных сертификатов, состояние отзыва и все связанные данные (включая закрытые ключи, если HSM не используется).

Для создания такой резервной копии просто запустите

$ clca backup [имя файла]

Это создаст резервную копию tar, сжатую gzip, в текущем каталоге. с именем YYYYMMDDHHMMSS-ca-backup.tar.gz , если имя файла не указано, в противном случае будет создан указанный файл.

Эта резервная копия содержит всю информацию для восстановления CA на состояние, в котором он находился, когда была запущена команда резервного копирования. Чтобы восстановиться к этому просто сотрите каталог $ CA_HOME и извлеките желаемый резервный архив. Это восстановит файл конфигурации, исполняемый файл ca и база данных сертификатов.

C.L. Деллумс: герой за гражданские права Окленда

Благодаря нашему архивисту Шону из Афроамериканского музея и библиотеки в Окленде у нас есть увлекательная запись в блоге о К.Л. Деллумс, житель Окленда, о котором вам следует знать.

Спасибо Шону, архивариусу Афроамериканского музея и библиотеки в Окленде за этот удивительный пост. Вы слышали о C.L. Деллумс?

Когда C.L. (Коттрелл Лоуренс) Деллумс прибыл в Окленд, штат Калифорния, в 1923 году, он мечтал однажды поступить на юридический факультет Калифорнийского университета. Он приехал в Калифорнию по тем же причинам, по которым в штат приехали другие афроамериканцы — чтобы избежать сегрегации и расизма Юга в надежде обрести социальное и экономическое равенство.

Но Деллумс вскоре понял, что дела в Калифорнии мало чем отличаются от Техаса, и единственными вакансиями, открытыми для афроамериканцев, были низкооплачиваемые должности в сфере обслуживания, такие как официанты, дворники, рабочие и носильщики на железной дороге. В конце концов Деллумс нашел работу носильщика на железной дороге в компании Pullman, планируя использовать свою зарплату в качестве носильщика для финансирования своего обучения. Он быстро понял, что его зарплата и график работы носильщиком не позволяют ему ходить в юридический институт, и был потрясен многочисленными несправедливостями, от которых страдали те, кто работал в поездах.К 1925 году К. Деллумс устал от неадекватной зарплаты и часто унизительных условий труда. Он призвал своих коллег-носильщиков присоединиться к нему в борьбе за лучшие условия труда. С прибытием А. Филипа Рэндольфа в Окленд осенью 1925 года Деллумс обнаружил средство для достижения своих целей — недавно созданное Братство носильщиков спящих вагонов (BSCP).

Деллумс провел большую часть следующих 65 лет своей жизни, защищая и борясь за лучшие условия труда для носильщиков в составе Братства.После того, как он был уволен компанией Pullman в 1927 году за его профсоюзную деятельность с Братством, он продолжил свою работу с BSCP и был назначен директором операций BSCP на Западном побережье и национальным вице-президентом в 1929 году. Деллумс и BSCP будут выиграть множество битв за заработную плату и условия труда, и компания Pullman в конечном итоге была официально признана руководством компании в 1937 году.

В дополнение к работе с профсоюзами Деллумс также тесно сотрудничал с общественными организациями и законодательными органами в борьбе за гражданские права.Он был избран первым председателем отделения округа Аламеда N.A.A.C.P. и руководил многими группами усилий по обеспечению справедливого жилья и занятости в соответствии с законодательством. После того, как четырем студентам из Государственного сельскохозяйственного и технического университета Северной Каролины было отказано в обслуживании за обеденным столом в универмаге Woolworth в Гринсборо, Северная Каролина, Деллумс возглавил бойкот и протест против магазинов Kress и Woolworth в районе залива. Неутомимый защитник прав рабочих и афроамериканцев, Деллумс активно сотрудничал с организациями и союзами гражданских прав до своей смерти в 1989 году в возрасте 89 лет.

Афроамериканский музей и библиотека в Окленде недавно завершил проект оцифровки документов Коттрелла Лоуренса, доступных в Интернете. Сборник служит отличным ресурсом для студентов и общественности, чтобы узнать о важной роли К.Л. Деллумс сыграл в истории гражданских прав афроамериканцев в Калифорнии и Братства носильщиков спящих машин.

Практическая работа 1
Тема: Основные понятия интерфейса Windows
Цели занятия:

— познавательная — познакомить слушателей с основными понятиями, интерфейсом и главным меню ОС Windows.

— развивающая – формирование новой системы понятий, связанных с графическим представлением интерфейса

— воспитательная – воспитание личностных качеств, обеспечивающих успешность исполнительской деятельности: дисциплинированности, внимательности, трудолюбия

1. 
   Настройте Рабочий стол по своему усмотрению: в контекстном меню рабочего стола Windows выберите команду Свойства и установите стиль оформления, выберите фон и заставку.
   
2. 
   Откройте Главное меню Windows и создайте на Рабочем столе ярлыки программ Paint и MS WORD и расположите их в правом нижнем углу экрана.
   
3. 
   В контекстном меню панели задач выберите команду Настройка даты/времени и уточните текущую дату и время.
   
4. 
   В контекстном меню панели задач выберите команду Свойства и настройте панель задач так, чтобы она автоматически исчезала с экрана.
   
5. 
   В контекстном меню панели задач выберите команду Свойства и уберите с панели задач индикатор языка, измените переключение раскладок клавиатуры.
   

Практическая работа 2

Тема: СТАНДАРТНЫЕ ПРОГРАММЫ WINDOWS «Блокнот» и WordPad,
Цели занятия:

— познавательная — познакомить слушателей с основными приемами ввода текста, форматированием шрифта и копирования фрагментов текста

— развивающая – формирование новой системы понятий, связанных с созданием текстового документа

— воспитательная – воспитание личностных качеств, обеспечивающих успешность исполнительской деятельности: дисциплинированности, внимательности, трудолюбия

Ответьте на вопросы:

1. Перечислите стандартные программы WINDOWS.

2. Перечислите служебные программы WINDOWS

3. Дайте сравнительную характеристику возможностей текстовых редакторов Блокнот и WordPad

4. Запустите программу «Блокнот» и наберите следующий текст:
Во второй половине прошлого столетия возникли ЭВМ, которые были созданы для облегчения труда математиков. Изучение информатики и средств вычислительной техники было необходимо для ученых, инженеров-программистов и для обслуживающего ЭВМ персонала.

С появлением персонального компьютера и информационных технологий постепенно к этой категории добавились бухгалтеры и клерки, писатели, журналисты и издатели, конструкторы и архитекторы, художники и дизайнеры, педагоги и учащиеся. Что же такое информатика?

Информатика — это комплексная наука об информации и информационных процессах, аппаратных и программных средствах информатизации, информационных и коммуникационных технологиях, а также о социальных аспектах процесса информатизации.
5. Скопируйте набранный текст и, запустив программу WordPad, вставьте его.

7. Добавьте заголовок «Практическое занятие», отцентрируйте его с помощью панели инструментов.

8. С помощью команды Формат — Шрифт измените шрифт заголовка: цвет — красный; тип — Arial; начертание — жирный с подчеркиванием.

9. Измените начертание и размер шрифта основного текста на 16 курсив.

С помощью команды Вставка — Объект вставьте после текста рисунок или фотографию из файла.

Практическая работа 3

Тема: ГРАФИЧЕСКИЙ РЕДАКТОР PAINT

Цели занятия:

— познавательная — познакомить слушателей с основными приемами создания и преобразования компьютерного рисунка

— развивающая – формирование новой системы понятий, связанных с созданием графического документа

— воспитательная – воспитание личностных качеств, обеспечивающих успешность исполнительской деятельности: дисциплинированности, внимательности, трудолюбия, креативность
Ответьте на вопросы:

1. Перечислите типы компьютерной графики.

2. К какому типу графики относятся рисунки, созданные с помощью Paint?

3. В каком формате сохраняются файлы, созданные в Paint, по умолчанию?

4. Перечислите известные вам форматы файлов компьютерной графики.

Практическое задание 1

1. Запустите программу Paint.

2. Создайте рисунок по предложенному образцу , используя: команды Копировать, Вставить, Отразить/повернуть; панель атрибутов текста; цветной ластик.

3. Сохраните рисунок в личной папке под именем «Яблоки».

4. Выделите рисунок, скопируйте его, откройте в личной папке файл Текст 1 и вставьте рисунок после второго абзаца. Закройте файл Текст 1, сохранив изменения.

5. Создайте в личной папке папку «Рисунки» и отправьте в нее файл Яблоки.
Практическое задание 2

1. Создайте рисунок «Домино» по предложенному образцу.

Примечание. При удерживании клавиши [Shift] применение инструментов Эллипс и Прямоугольник дает соответственно окружность и квадрат, а прямая линия получится вертикальной, горизонтальной или под углом 45.

Сохраните рисунок в папке «Рисунки» под именем «Домино».

Создайте рисунок «Схема проезда» по предложенному образцу.

Сохраните рисунок в папке «Рисунки» под именем «Проезд».

Рис. 1.3
Практическое задание 3
Создайте рисунок по образцу (рис. 1.4) с помощью инструмента Кривая.

Сохраните рисунок в папке «Рисунки» под именем «Море».

Следующий рисунок (рис. 1.5) выполните, используя инструмент Кривая, команды Копировать, Вставить, Отразить/повернуть.

рис. 1.4 рис. 1.5

Практическая работа 4.

Тема: ТЕКСТОВЫЙ РЕДАКТОР WORD. ФОРМАТИРОВАНИЕ ШРИФТА

Цели занятия:

— познавательная — научить слушателей основным приемам форматирования шрифта в текстовом редакторе WORD

— развивающая – формирование новой системы понятий, связанных с созданием текстового документа

— воспитательная – воспитание личностных качеств, обеспечивающих успешность исполнительской деятельности: дисциплинированности, внимательности, трудолюбия.

Сформулируйте определение:

Текстовый редактор — это __________________________________________

Ответьте на вопросы:

1. Какие текстовые редакторы вам известны?

2. В какой пакет программ входит текстовый редактор WORD?

3. Перечислите основные возможности текстового редактора WORD

4. Какие средства форматирования шрифта вы знаете?

Практическое задание 1
Создайте в личной папке папку «Документы».

Запустите программу WORD.

Начните выполнение задания с заголовка «Практическое задание». Поступайте так и в дальнейшем.

4. Наберите текст с соблюдением всех элементов форматирования, используя диалоговое окно Шрифт или соответствующие кнопки на панели инструментов
Шрифты
Шрифт — это набор букв, цифр, специальных символов и знаков препинания, отображаемых определенным образом. В понятие шрифта входят: тип шрифта, размер шрифта, начертание, цвет, специальные эффекты.

Наиболее распространенными шрифтами в России являются Times ET, Times New Roman Schoolbook, Optima, Arial New и т.д.

Размер обычно выражается в пунктах, или point. Один пункт соответствует 0,376 мм (американская единица — Pica Point соответствует 0,351 мм).

Для основного текста обычно выбирают размер 12, 14, для заголовков — более крупные размеры (16 и выше), для сносок и примечаний — 10.

Процесс форматирования сводится к установке требуемых параметров для символов. Можно осуществить форматирование ранее введенного текста или выполнить установки, после чего вводимый текст будет форматироваться необходимым образом.

Основные параметры шрифта (тип, размер и начертание) назначаются с помощью команды Формат, панели инструментов «Форматирование», клавиш и контекстного меню.

Возможности WORD при работе со шрифтом
Выбор гарнитуры (типа шрифта). Выберите различные типы шрифта для одного предложения, в скобках укажите название шрифта:
Современный персональный компьютер может быть реализован в настольном (desktop), портативном (notebook) или карманном (handheld) варианте [Times New Roman Cyr].
Современный персональный компьютер может быть реализован в настольном (desktop), портативном (notebook) или карманном (handheld) варианте [Arial Cyr].
Современный персональный компьютер может быть реализован в настольном (desktop), портативном (notebook) или карманном (handheld) варианте [GaramondNarrowC].
Современный персональный компьютер может быть реализован в настольном (desktop), портативном (notebook) или карманном (handheld) варианте [Courier New Cyr].

Современный персональный компьютер может быть реализован в настольном (desktop), портативном (notebook) или карманном (handheld) варианте [GOST type A].
II. Различное начертание букв (ж, к, ч):
Можно использовать разные сочетания начертаний.
III.Выбор размера шрифта. Размер шрифта измеряется в специальных единицах — пунктах. Чем больше пунктов, тем больше буквы.

Напечатайте числа, устанавливая размер шрифта, равный числу:

16 18 20 22 24 26 28 29 30
IV. Напечатайте фразу, выполняя каждую букву разным цветом:

Биты и байты.
V. Напечатайте формулы, используя верхний и нижний индексы:

СН₄ + 20₂ = С0₂ + 2Н₂0

(а + Ь)² = а² + 2аЬ + b².
VI. Напечатайте фразу, с использованием различных межбуквенных интервалов (меню шрифт, вкладка Интервалы):

Текстовый процессор — обычный интервал.

Текстовый процессор — разреженный на 2 пт.

Текстовый процессор— разреженный на 4 пт.

Текстовый процессор — уплотненный на 1 пт.

Практическая работа 5

Тема: ФОРМАТИРОВАНИЕ АБЗАЦА

Цели занятия:

— познавательная — научить слушателей основным приемам создания и форматирования абзаца

— развивающая – формирование новой системы понятий, связанных с созданием текстового документа

— воспитательная – воспитание личностных качеств, обеспечивающих успешность исполнительской деятельности: дисциплинированности, внимательности, трудолюбия

Левый край текста

Правый край текста

Красная (висячая) строка

Ответьте на вопросы:

1. Что такое абзац?

2. Какую команду следует выполнить для установки всех параметров абзаца?

3. Каковы функции бегунков линейки?

левый верхний треугольник устанавливает …

левый нижний треугольник …

правый треугольник …

прямоугольник …

4. Как называется инструмент, позволяющий повторить все параметры

форматирования какого-то абзаца для других абзацев документа?

Практическое задание 1

1. Наберите текст, содержащий информацию о ПК и программе WORD, с соблюдением параметров форматирования, указанных в скобках и выравниванием текста.
Слово «компьютер» означает «вычислитель», т. е. устройство для вычисления. Это связано с тем, что первые компьютеры создавались как устройства для вычислений: усовершенствованные автоматические арифмометры. (По левому краю.)
Принципиальное отличие компьютеров от арифмометров и других счетных устройств (счет, логарифмических линеек и т.п.) состояло в том, что арифмометры могли выполнять лишь отдельные вычислительные операции.

(По правому краю.)

Компьютеры позволяют проводить без участия человека сложные последовательности вычислительных операций по заранее заданной инструкции — программе. Хотя компьютер создавался для численных расчетов, скоро оказалось, что они могут обрабатывать и другие виды информации. (По ширине.)
Межстрочный интервал

Microsoft Word — мощный текстовый редактор, предназначенный для выполнения всех процессов обработки текста: от набора и верстки до проверки орфографии, вставки в текст графики, распечатки текста. MS Word позволяет работать со многими шрифтами. MS WORD имеет множество полезных свойств, например: автоматическая коррекция текста по границам, автоматический перенос слов и правка правописания слов, сохранение текста в определенный устанавливаемый промежуток времени, наличие мастеров текста и шаблонов, позволяющих в считанные минуты создать деловое письмо, факс, автобиографию, расписание, календарь и многое другое. (Одинарный интервал.)
MS Word обеспечивает поиск заданного слова или фрагмента текста, замену его на указанный фрагмент, удаление, копирование или замену по шрифту, гарнитуре или размеру шрифта, а также по надстрочным или подстрочным символам. Наличие закладки в тексте позволяет быстро перейти к заложенному месту в тексте. Можно также автоматически включать в текст дату, время создания, обратный адрес и имя написавшего текст. (Полуторный интервал.)

MS Word позволяет при помощи макрокоманд включать в текст базы данных или объекты графики, музыкальные модули в формате *wav. Для ограничения доступа к документу можно установить пароль на текст, который MS Word будет спрашивать при загрузке текста для выполнения с ним каких-либо действий. MS Word позволяет открывать различные окна для одновременной работы с несколькими текстами, а также разбить одно активное окно по горизонтали на два. (Интервал «точно» 12 пт.)

Практическое задание 2

Наберите текст с соблюдением параметров форматирования, указанных в скобках и выравниванием текста.

Отступы

Практическая работа 2.2.2
1. Наберите стихи А.А.Ахматовой, соблюдая все элементы форматирования.

Внимание. Пробел ставится между словами и притом один.

Отступы

Создание документа начинается с выбора шаблона, т. е. готовой пустой заготовки документа определенного назначения (обычный документ, визитная карточка, резюме и др.). Шаблоны задают структуру документа, которую пользователь заполняет определенным содержанием. (Отступ первой строки абзаца.)

Для создания документов со сложной структурой используются Мастера. Например, целесообразно использовать мастер при создании факсов, так как общепринятая форма факсов должна содержать обязательный набор правильно размещенных на странице полей: Кому, От кого, Дата и др. (Выступ первой строки абзаца.)

В процессе работы над документом иногда бывает необходимо заменить одно многократно встречающееся слово на другое, например слово «ЭВМ» на слово «компьютер». В этом случае можно использовать функцию текстового редактора Найти и Заменить. При вводе запросов на замену можно использовать звездочку (*), которая маскирует произвольное число символов. (Отступ всего абзаца слева.)

Объектно-ориентированный подход позволяет реализовать механизм встраивания и внедрения объектов (OLE — Object Linking Embedding). Этот механизм позволяет копировать и вставлять объекты из одного приложения в другое. Например, работая с документом в текстовом редакторе Word, в него можно встроить изображения, анимацию, звук и даже видеофрагменты. (Отступ всего абзаца справа.)

Современные системы машинного перевода позволяют достаточно качественно переводить техническую документацию, деловую переписку и другие специализированные тексты. Однако они не применяются для перевода художественных произведений, так как не способны адекватно переводить метафоры, аллегории и другие элементы художественного творчества человека. (Комбинация отступов)

Технологическая карта к уроку «Работа с текстовым редактором». Практическая работа №4 «Набор и редактирование текста», 7 класс

Боровикова Светлана Александровна,

учитель информатики и математики

МБОУ «СОШ №12». 

Город Северодвинск, Архангельская область.

Дата: _______________ Конспект урока №15

Тема: Работа с текстовым редактором.

Практическая работа №4 «Набор и редактирование текста»

Тип урока: комбинированный урок.

Планируемые образовательные результаты:

предметные – представления о вводе и редактировании текстов как этапах создания текстовых документов;

метапредметные – широкий спектр умений и навыков использования средств информационных и коммуникационных технологий для создания текстовых документов; навыки рационального использования имеющихся инструментов;

личностные – понимание социальной, общекультурной роли в жизни современного человека навыков квалифицированного клавиатурного письма.

Решаемые учебные задачи:

1) рассмотрение рекомендаций, которых следует придерживаться при работе на клавиатуре;

2) актуализация основных правил ввода текстовой информации;

3) систематизация сведений об операциях на этапе редактирования текстовых документов на компьютере (вставка, удаление и замена символов, работа с фрагментами текстов, проверка правописания, расстановка переносов).

Приобретаемые умения и навыки:

Использование знаков препинания при наборе текста.

Использование режимов вставки и замены при наборе текста.

Вставка символов.

Удаление символов.

Объединение строк.

Разделение строк.

Загрузка файла.

Сохранение файла на диске.

Основные понятия, рассматриваемые на уроке:

набор (ввод) текста; редактирование (правка) текста; режим вставки/замены; проверка правописания; поиск и замена; фрагмент; буфер обмена.

Условные обозначения: УД — учебная деятельность; Ф — фронтальная деятельность; И — индивидуальная деятельность; П — парная деятельность, Г – работа в группах, СС – самопроверка и самооценка, ПР – практическая работа на компьютерах.

Список использованных источников

Информатика и ИКТ: учебник для 7 класса / И.Г. Семакин, Л.А. Залогова, С.В Русаков, Л.В. Шестакова. – 6-е изд., стереотип. – М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2017.

Редактирование текста / http://resh.edu.ru/subject/lesson/1110/ (Дата обращения: 10.01.2018 г.)

ЦОР «Информатика-базовый курс», 8 класс, Семакина И., Залоговой Л., Русакова С., Шестаковой Л., издательство «Бином. Лаборатория знаний» / http://school-collection.edu.ru/ (Дата обращения: 10.01.2018 г.)

Практические работы в Microsoft Word 5 – 6 класс

Князева Гузель Анваровна

МБОУ СОШ № 21,

г. Озерск, Челябинская область

учитель информатики

Практические работы в MicrosoftWord

5 – 6 класс

Задание 1. Наберите текст:

Славное утро

Мне было тогда лет шесть. Я возился в куче песка около дома. Знакомый конюх Иван Максимович подъехал к крыльцу на беговых дрожках. Я бросил лопатку и подбежал к нему.

Иван Максимович посадил меня на дрожки, обнял одной рукой и стал другой рукой помогать мне править лошадью. Мы объехали с ним вокруг сада и через три минуты вернулись к подъезду.

На крыльце я увидел маму. Рядом с ней стоял дядя Володя, который держал ружьё. Наверное, он собрался на охоту.

«Дядя, возьми меня с собой!» — взмолился я. Мама строго спросила: «А ты будешь есть за обедом все, что я тебе даю?» «Конечно, буду!» — кричал я. «Ты возьмешь его, Володя?» — обратилась она к брату. Тот кивнул головой.

Задание 2. Вставить пропущенные буквы.

Вес..ник, пр..сить, праз..ник, со..нце, к..л..кольчик, л..ша..ка, счас..ливый, лес..ница, м..л..дец, в..р..ненок, глуб..ко, ч..рника, у м..ста, пишу п..ром, радос..ный, чудес..ный.

Задание 3. Удалите лишние слова или символы

1. На картинах картинах были нарисованы сорокккки, вороны и воробьи.

2.Я любббблю слушать, как поют поют поют соловьи соловьььи.

3. Вощщщзллллле мааойевого дома нахо00диееется березовая роща.

4. В наааашшшшеееем нашем гороооодке плаааохииииеее дороги. 

Задание 4. Выделите каждое слово цветом, соответствующим названию:

ЖЕЛТЫЙСИНИЙОРАНЖЕВЫЙ

ЧЕРНЫЙКРАСНЫЙЗЕЛЕНЫЙ

Фиолетовыйжелтыйкрасный

Оранжевыйзеленыйчерный

Синийкрасныйфиолетовый

Зеленыйсинийоранжевый

Задание 5. Вместо многоточия добавьте слова так, чтобы получились распространённые предложения.

Ударили ….  морозы. Снега засыпали ….. . Природа уснула ….. . . ………..  ветер гуляет ………. . Птицы летят …………….

ЗАДАНИЕ 6. Используя операцию Вырезать и Вставить соедините начало и конец предложения.

С первыми тяжёлыми каплями дождярыбки плюхнулись в воду

У самого берегаогромная чёрная туча.

Над озером навиславиляли хвостом рыбешки.

Каждый раз явздрагивал от грома.

Задание 6. Наберите текст на английском языке.

My mother is a teacher of English. She knows three languages and she reads, writes and speaks them very well. She works at school and she likes her work very much. My father is a driver. He works from morning till late at night. He comes home at nine o’clock in the evening. I am ten years old. I am a pupil. I like going to school. I study well.

Практическая работа №4 Microsoft Word. «Набор и редактирование текстового документа»

Обработка текстовой информации

Обработка текстовой информации

Компьютер — основной инструмент подготовки текстов

Текстовый редактор

Ввод текста

Подготовка текстов — одна из самых распространённых сфер применения компьютеров. На любом компьютере установлены специальные программы, предназначенные для создания текстов — текстовые редакторы.

Вы уже знакомы с текстовым редактором Блокнот. С его помощью можно создавать простые тексты, состоящие из букв, цифр, знаков препинания и специальных символов, которые можно ввести с помощью клавиатуры.

Для создания и оформления рассказов, докладов, статей для школьной газеты, содержащих надписи, таблицы, схемы, рисунки, фотографии, используют более мощные текстовые редакторы. Их ещё называют текстовыми процессорами.

В группе программ Стандартные находится текстовый процессор Word Pad.

Окно текстового процессора имеет следующий вид:

Этапы подготовки документа на компьютере